1，目标蛋白性质的了解：在纯化之前，了解目标蛋白的分子量、稳定性、可溶性、等电点等性质，这些因素会影响实验流程。
2，蛋白表达位置的确定：考虑蛋白是在细胞内、分泌到培养基中还是膜蛋白，选择合适的样品进行纯化。
3，选择合适的表达体系：如果需要短时间内获得大量蛋白，构建质粒在模式细胞中表达是一个好选择。
4，纯化方法和层析路线的选择：根据蛋白的特性选择合适的纯化方法，如亲和层析、凝胶过滤层析、离子交换层析等，并考虑多种方法联用以提高纯度。
5，缓冲液的pH和组成：注意缓冲液的pH值和组成，避免使用含有鳌合剂及还原剂的缓冲液，这些可能会影响镍柱的性能。
6，蛋白不溶解或沉淀：调整缓冲液的pH值，增加盐浓度，避免蛋白聚集沉淀以及影响后续过镍柱时的非特异性吸附。
7，蛋白不吸附：检查标签是否暴露，选择作用力更强、配基密度更高的填料，确保样品和缓冲液的pH一致，避免蛋白在缓冲液中会出现沉淀的可能。
8，难洗脱：如果目标蛋白难以洗脱，可以尝试使用更强的洗脱条件，如500mM咪唑，或者使用500mM咪唑加8M脲去洗脱，也可适当降低洗脱液的PH值，因为PH值有利于组氨酸标签与Ni离子的解离。
9，纯化步骤的温和性：纯化条件应尽量温和，以保持蛋白的功能结构，如蛋白在常温下不太稳定，可以采用低温的条件进行纯化。
10，流速控制：在纯化过程中，流速不应过快，以确保蛋白与镍柱充分结合。
11，多步纯化：如果单一纯化方法不能达到理想的纯度，可以考虑多步纯化，如利用Strep标签进行两步纯化或采用后续增加离子交换柱的方式进行纯化。
12，镍柱的再生：当镍柱颜色变化时，需要使用6M盐酸胍+0.2M乙酸或2%SDS等试剂进行再生处理。
13，缓冲液的具体组成：例如，Bind Buffer可用50mM PBS，0.5M NaCl，pH7.4；Wash Buffer可用50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 20mM 咪唑，pH8.0；Elution Buffer可用50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 250mM 咪唑，pH8.。
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