大肠杆菌因其易于培养、生长周期短、发酵密度高、重组蛋白表达效率高以及成本低廉等优势，被广泛采用作为重组蛋白的生产宿主。据数据表明，超过30%的重组蛋白药物和50%的重组蛋白制备都是利用大肠杆菌来实现的。然而，尽管大肠杆菌在表达体系中具有诸多优势，它在实际应用中也存在一些限制，主要问题包括：1. 缺乏翻译后修饰：与真核表达系统相比，原核系统如大肠杆菌的一个主要限制是缺少真核生物所具有的翻译后修饰能力，例如糖基化和二硫键的正确形成。这些修饰对于重组蛋白的溶解性、稳定性和生物活性至关重要。2. 缺乏辅助蛋白质折叠机制：原核表达系统缺少帮助蛋白质正确折叠的机制，导致重组蛋白在表达过程中往往自行折叠，形成特定的三维结构。对于结构复杂或疏水性强的蛋白质，这种自发折叠容易导致错误折叠，最终可能形成无活性的包涵体。因此，为了最大限度地减少不溶性蛋白的产生，选择最合适的表达宿主和优化培养条件以提高目标蛋白的表达至关重要。
①. 氨基酸组成：含硫氨基酸和脯氨酸的含量与比例对蛋白质的表达形式有显著影响。含硫氨基酸如半胱氨酸，对蛋白质结构的稳定性至关重要，但在大肠杆菌的还原性胞质环境中，二硫键难以形成，导致蛋白质稳定性下降。脯氨酸因其特殊结构，对蛋白质折叠过程有显著影响，可能导致蛋白质错误折叠。
②. 亲疏水性：蛋白质的疏水性强弱影响其折叠和聚集。疏水相互作用驱动蛋白质折叠，而分子间疏水作用可能导致蛋白质聚集。蛋白质的疏水性越强，越容易因疏水作用而聚集，增加错误折叠的风险。③. 蛋白质合成速度：大肠杆菌的快速蛋白质合成速度对复杂结构蛋白质的折叠构成挑战。高浓度的蛋白质和快速的合成速度可能导致蛋白质折叠不充分，增加聚集形成包涵体的风险。④. 分子大小和结构复杂性：较大的蛋白质分子和复杂的结构使其折叠过程中需要克服更多的势能壁垒，降低准确折叠的概率。大分子蛋白质在大肠杆菌中表达时，由于折叠困难，更容易形成包涵体。⑤. 结构折叠难易程度：蛋白质的高级结构类型，尤其是二级结构的组成比例，影响其折叠速度。例如，α螺旋结构比β折叠结构折叠速度更快，更稳定。⑥. 二硫键的形成：二硫键对蛋白质的正确折叠和稳定性至关重要。大肠杆菌胞质的还原性环境不利于二硫键的形成，而周质环境更有利于氧化形成二硫键。重组蛋白质中二硫键的形成困难可能导致蛋白质聚集。2，提高重组蛋白质在大肠杆菌体系中可溶性表达的策略影响重组蛋白质在大肠杆菌体系中表达形式及表达水平的因素很多，可分为主观性因素和客观性因素，见下图。主观性因素包括氨基酸组成、蛋白质自身结构、亲疏水性及二硫键数量等，客观性因素包括表达宿主类型及场所、融合表达或非融合表达、是否有分子伴侣、诱导条件、载体类型等。改善或提高重组蛋白质在大肠杆菌体系中可溶性表达的策略主要针对以上主客观因素进行优化。![]()
①. 密码子优化：由于不同物种中同工tRNA的丰度存在差异，特定的同义密码子在蛋白质翻译过程中的使用频率并不一致。在大肠杆菌中，某些密码子的使用具有显著的倾向性，这直接影响了重组蛋白质的表达。含有大量稀有密码子的目的基因在大肠杆菌中可能导致翻译限速或停滞，进而影响蛋白质的正确折叠。通过优化密码子，使其与大肠杆菌中丰富的同工tRNA相匹配，可以提高翻译效率，从而促进蛋白质的顺畅表达和正确折叠。②. 诱导表达温度优化：温度对大肠杆菌的生长、质粒稳定性、重组蛋白质的表达速度以及蛋白质折叠效率都有显著影响。虽然大肠杆菌的最佳培养温度为37℃，但这一温度可能不利于某些蛋白质的表达和折叠。在37℃下，某些蛋白质的溶解度可能降低，易于形成聚集体，从而降低可溶性蛋白质的表达比例。由于疏水作用对温度敏感，过高的温度会加速蛋白质间的聚集。适当降低培养温度可以减缓细菌的新陈代谢速度，降低转录和翻译速度，这有助于蛋白质的正确折叠。较低的温度还能减弱蛋白质间的聚集作用，提高重组蛋白质的可溶性表达比例。需要注意的是，降低温度可能会减少最终的生物量，因为蛋白质合成率降低，可能需要更长的诱导时间来获得理想的蛋白质产量。③表达载体选择与优化：表达载体通常包含复制子、筛选标记基因、启动子和转录终止子等关键元件，这些元件共同决定了载体的功能和适用性。大肠杆菌中常用的表达载体包括pET系列、pCold系列、pBV系列和pGEX系列等，它们各自具有不同的元件组合，以适应不同的蛋白质表达需求。启动子的类型对目的基因的表达水平和蛋白质的溶解性有显著影响。选择载体时，应优先考虑启动子的启动效率，以确保目的基因的表达产物能占菌体总蛋白质的10%~30%。常见的大肠杆菌表达体系启动子包括细菌源的lac、tac、trp、araBAD启动子，以及噬菌体源的T7、T5、SP6启动子。pET系列载体因其T7强启动子而广泛使用，T7启动子由T7 RNA聚合酶驱动，其转录速度比细菌RNA聚合酶快近5倍，从而实现高表达量。虽然强启动子如T7可以提高表达量，但它们也可能导致目的蛋白快速累积，增加包涵体形成的风险。相比之下，较弱的启动子在转录和翻译过程中提供更平缓的表达强度，有助于减少重组蛋白质折叠前体的累积，从而改善蛋白质的可溶性表达。④诱导条件的优化：IPTG（异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷）是大肠杆菌表达系统中常用的诱导剂，通过模拟乳糖的作用，激活lac操纵子，启动目的基因的转录。IPTG的工作浓度通常在0.1~1 mmol/L。过高的IPTG浓度可能导致重组蛋白质过度累积和包涵体形成，而过低的浓度则可能无法有效启动转录。实验表明，当IPTG浓度高于10 μmol/L时，重组蛋白质的表达水平在4小时内无明显差异；而在1~10 μmol/L范围内，表达水平与IPTG浓度呈现较好的依赖性。自动诱导是一种无需额外添加IPTG的策略，通过在培养基中添加葡萄糖和乳糖的比例控制，使细菌优先利用葡萄糖，待其耗尽后才开始利用乳糖，从而逐步启动T7 RNA聚合酶的表达。这种策略的优势在于诱导过程温和，避免了突然的蛋白质合成压力，有助于提高重组蛋白质的可溶性。温控诱导包括高温诱导和低温诱导两种方式。高温诱导：利用温度敏感的阻遏物cIts857，在30℃下抑制转录，42℃时阻遏解除，启动转录。这种方法无需添加外来诱导物，但升温会加速细菌代谢和蛋白质合成，增加折叠负担。为减轻负担，可以在42℃下短暂诱导后，将温度降至35℃以下。低温诱导：使用冷休克基因CspA作为启动子，通过降低温度来控制目的基因的转录。低温诱导可以减缓细菌代谢和蛋白质合成速度，减少包涵体的形成，提高重组蛋白质的可溶性。⑤大肠杆菌表达宿主选择：为了优化重组蛋白质在大肠杆菌中的表达，多种经过特殊设计的大肠杆菌宿主细胞被开发出来，以提高蛋白质的表达水平、促进二硫键的正确形成、改善蛋白质的可溶性。常见的大肠杆菌宿主主包括E. coli BL21系列、Rosetta系列和Origami系列等。E. coli BL21系列：这是最常用的宿主细胞，用于常规蛋白质表达。BL21及其衍生物缺乏ompT和lon蛋白酶，这有助于减轻T7 RNA聚合酶以及重组蛋白质和错误折叠蛋白质的降解。BL21 Star：这是BL21的一个变种，其RNA基因中包含一个额外的突变，导致mRNA的稳定性增强，从而增加蛋白质的表达。与普通BL21相比，BL21 Star在异源蛋白质表达上可显著提高2到10倍。Rosetta系列：这些宿主细胞的特点在于它们提供编码罕见tRNA的质粒，这有助于含有高频率罕见密码子的基因的有效表达。Origami系列：这些菌株在硫氧还蛋白还原酶（trxB）和/或谷胱甘肽还原酶（gor）基因中存在突变。这些突变有助于维持细菌胞质的还原环境，促进二硫键的形成，从而有利于含二硫键的重组蛋白质的正确折叠和可溶性表达。此外，通过将不同宿主的特性进行组合，如Rosetta-gami等，可以进一步丰富大肠杆菌表达宿主的功能性，满足更多样化的蛋白质表达需求。
⑥细菌培养条件优化：大肠杆菌的培养环境也是影响外源蛋白质可溶性表达的关键因素之一，这些因素包括温度、pH、微量元素等。温度的优化：温度对细菌的生长和重组蛋白质的表达有多重影响，包括生长速度、蛋白质合成速度、蛋白质折叠和聚集倾向、蛋白质的稳定性和生物活性，以及溶解度。降低培养温度通常有利于提高重组蛋白质的可溶性表达，因为低温可以减缓蛋白质的合成速度，给予更多的时间进行正确的折叠，减少错误折叠和聚集。pH值的调整：pH值对蛋白质的表达和溶解性有显著影响。大肠杆菌的最适生长pH为6.5至7.5，选择与目的蛋白质等电点差异较大的pH值，有助于提高蛋白质的溶解性。根据菌体和目的蛋白质的特性，选择合适的pH值，并在培养过程中保持pH的相对稳定，对于优化蛋白质的表达和溶解性至关重要。微量元素的补充：微量元素如Zn²⁺、Mg²⁺等对蛋白质的表达形式有积极作用。研究表明，向培养基中添加适量的微量元素可以提高目的蛋白的可溶性表达。这些金属离子可能通过提高某些酶的活性，促进异源蛋白质二硫键的正确形成，从而增强蛋白质的折叠和稳定性。⑦促溶标签融合表达：促溶标签融合表达是一种提高重组蛋白质产率和可溶性的有效策略。常用促溶标签包括麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、小泛素样修饰蛋白( SUMO)和硫氧还蛋白(Trx)等。MBP是一种有效的增溶标签，可以增强重组蛋白质的溶解度，甚至能够促进未折叠或错误折叠蛋白质的溶解。GST也是一种常用的融合标签，但相比MBP，其增溶效果较弱，部分原因是GST自身可能形成二聚体。SUMO具有强大的促溶功能，可以提高蛋白质的稳定性和溶解度，可能通过分子伴侣的作用促进蛋白质的正确折叠。SUMO可融合于目的蛋白的N端，SUMO具有自己的高度特异性蛋白酶(Ulp)，识别SUMO蛋白的三级结构，可将SUMO标签C端残基后（除Pro残基外）的完整蛋白质酶解断裂释放出来，目的蛋白无任何氨基酸序列残留。Trx是一种氧化还原酶，通过硫代二硫键交换来还原二硫键，有助于增加重组蛋白质的可溶性，Trx可以融合到目的蛋白质的N端或C端。避免包涵体形成。融合标签的融合位点对蛋白的可溶表达也很重要，融合标签通常融合在目的蛋白质的N端或C端，其中N端融合往往效果更佳，因为这样可以在翻译过程中先合成促溶标签，有助于后续蛋白质序列的正确折叠。虽然融合标签可以提高蛋白质的可溶性，但它们的存在可能会干扰蛋白质的生物活性。因此，在大多数情况下，需要去除融合标签，这在一定程度上增加了工艺成本。为了简化纯化步骤，促溶标签通常与亲和纯化标签（如6xHis-SUMO）共融合表达，可以通过特定的蛋白酶识别序列实现标签的切除，再通过亲和层析将6xHis-SUMO标签与目的蛋白分开，以此获得无标签蛋白。
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