蛋白产品生产中的挑战--蛋白质聚体

文摘 2024-09-20 07:04 江苏

在生物原料药（API）的生产过程中，去除蛋白质聚体是一个关键步骤，因为这些聚体可能会增加药物的免疫原性。蛋白质聚体主要在上游工艺阶段形成，而且随着生产过程中分子浓度的提高，聚体形成的风险也随之增加。然而，如果下游加工过程中采用了不恰当的操作条件，也可能导致蛋白质聚集。因此，了解蛋白质聚体形成的机制，并通过在生产过程中的对影响蛋白聚体形成的因素进行控制，可以有效降低或防止蛋白聚体的产生。

聚合机制

蛋白质聚集的机制主要分为两种：一种是蛋白质从其天然状态解折叠到变性状态，导致内部疏水结构的暴露，这些结构能够与其他分子的疏水表面相互作用，从而形成聚体。另一种是蛋白质通过其外表面区域的疏水区域相互作用而聚集。蛋白质聚集涵盖了从二聚体形成到由于疏水性介导的非共价相互作用以及通过链间未配对硫醇基团配对的共价相互作用引起的可见颗粒等一系列分子行为。

聚体的形成受多种因素影响，包括溶液条件（如电导率和pH值）、蛋白质浓度、温度等。较小的聚体通常可溶，而较大的聚体则不溶。聚集过程可能是可逆的，尤其是来自小聚集体的情况，或者是不可逆的，尤其是当基于变性蛋白质时。此外，不完全折叠和未折叠产物的数量以及未配对的半胱氨酸残基的存在也会影响聚体的形成。

在纯化过程中，需要特别注意可能导致聚集的条件，并采取措施避免或减轻这些条件的影响。不溶性聚体的再溶解不仅需要额外的工艺步骤，而且成本高昂，还会影响整体工艺的产量。因此，优化生产和纯化条件以减少聚体的形成对于提高生产效率和降低成本至关重要。

在生物制药的下游加工过程中，通过利用治疗分子和杂质（如聚体）在亲和力、电荷、大小、疏水性以及其他理化特性上的差异，可以实施多个步骤以实现目标产品的回收和纯化。这些步骤包括离心、不同种类的层析技术（如亲和层析、离子交换层析、疏水层析等）、过滤、重折叠以及沉淀等工艺的开发。所有这些操作步骤，如色谱层析、病毒灭活、病毒过滤和其他过滤模式，都可能在某些条件下导致蛋白质聚集，这些条件包括pH值和电导率的变化、高蛋白质浓度以及剪切力。

为了在下游加工过程中最小化蛋白质聚集的形成，可以采取以下策略：①选择适宜的溶液条件和纯化用的固定相（特别是在色谱过程中），以防止聚集并稳定蛋白质。②在纯化所需的条件下，有时通过添加赋形剂或其他添加剂来稳定蛋白质。赋形剂如抗氧化剂（例如抗坏血酸和谷胱甘肽）可以防止蛋白质因活性氧氧化而产生聚集位点，例如在赖氨酸基团上形成醛，这些醛可以进一步反应形成共价席夫基聚体。

离心和过滤与蛋白聚体

在生物制药的下游加工中，离心是一种常用的分离技术，但这一过程可能会对蛋白质造成一定的物理影响。具体来说，蛋白质在进入离心转子的进料区域时可能会遭受强烈的剪切力。这种剪切力不仅可能直接导致蛋白质聚集，还可能通过细胞裂解过程中的酶促反应间接促进蛋白质聚集。此外，在离心和过滤过程中，蛋白质在气液界面的暴露也可能增加可溶性或不溶性聚体的形成。

庆幸的是，技术的进步正在帮助解决这些问题。例如，现代离心机采用气密密封设计，这可以最大限度地减少蛋白质在气液界面的暴露。同时，可以使用真空泵以最小的气流和转速进行操作，从而减少对蛋白质的剪切力。此外，通过优化离心过程中的溶液条件，也可以有效减少剪切力对蛋白质的影响。

色谱层析与蛋白聚体

色谱技术是生物制药中用于纯化蛋白质的主要手段，但它也可能成为蛋白质形成聚体的潜在环节。以下是色谱过程中可能导致蛋白聚集的几个关键步骤及其优化方法：①离子交换色谱：利用电荷差异将目标蛋白与杂质分离。如果不加以控制，蛋白质在介质的固定相上吸附时可能会解折叠，导致聚体形成。为了避免这种情况，应选择合适的固定相，以减少二次相互作用，并在适宜的温度和pH值下进行洗脱。②疏水相互作用色谱：用于去除基于疏水性的杂质。强疏水相互作用可能导致聚体形成，这也可能改变产品表面的结构。选择合适的固定相和操作条件对于减少聚集至关重要。③亲和技术的进步：某些亲和配体/层析树脂设计用于在较低酸性或中性pH值条件下进行洗脱，有助于减少聚集。如蛋白A层析通常作为捕获步骤，用于从细胞培养物中去除大量杂质。这一步骤需要在低pH值下进行洗脱，随后进行低pH值灭活潜在的外来病毒。在这两个步骤中，蛋白质暴露于低pH值环境可能导致不稳定和聚集。为了减少这种风险，某些厂家优化的蛋白A填料可以选择在更接近中性pH值的条件下进行洗脱。

蛋白复性和保存与蛋白聚体

蛋白重折叠复性：在大肠杆菌发酵过程中，产物可能以包涵体形式存在。重折叠复性过程旨在将这些包涵体转化为活性产物，但这一过程可能导致蛋白聚体的形成。优化重折叠条件可以减少聚体。

蛋白保存：在下游加工过程中，产品可能需要在完成一个步骤后保存，直到下一个步骤准备好。不当的保存条件可能导致结构变化和蛋白聚集。采用连续加工方法可以减少蛋白质在不利环境中的停留时间。

如何避免纯化过程造成的聚体

为了降低生物制剂生产过程中蛋白质聚体的风险，业界已经采取了一系列策略，从细胞系的选择到工艺设计，都在努力减少聚体倾向。以下是一些关键的进展和方法：①细胞系和单克隆选择：在开发早期，许多公司专注于研究具有良好生产力的单克隆细胞系，以识别与纯化相关的特征。这样可以在早期阶段筛选掉那些容易产生高聚合水平或不稳定、有自关联倾向的克隆，从而在源头上控制聚体。②源头控制：通过在细胞表达阶段控制蛋白质的表达，可以最大限度地减少聚体形成和其他与产品相关的杂质问题。这种方法比在下游操作中解决问题更为有效。③高通量筛选技术：在候选选择阶段，使用高通量筛选技术来选择那些不太容易聚体的蛋白质构建体，以及可以进一步减少聚体的细胞系和细胞培养条件。④生物信息学的应用：生物信息学在分子设计中的应用越来越广泛，目标是通过改进活性生物制剂的表面设计来降低疏水性和增加亲水性，例如增加带电氨基酸的数量和消除未配对的半胱氨酸。⑤高压技术：科罗拉多大学正在探索使用高压技术来分解和重新折叠蛋白质，以控制和逆转蛋白聚集。这项技术可能带来的好处和挑战仍在评估中。⑥工艺设计的优化：通过仔细选择和工艺设计，可以开发出能够抵抗聚集的活性生物制剂，从而降低生产过程中的蛋白聚集的倾向。

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