蛋白纯化之微生物细胞破碎技术

文摘 2024-10-14 08:40 江苏

为了能有效地破碎细胞，并尽可能减少产物的破坏,已发展了多种细胞破碎的方法，通常可分为机械法和非机械法两类。

一，机械法

常用的机械破碎方法是基于液相或固相剪切力，这些剪切力可以在高压匀浆器或机械驱动的破碎机如胶质磨、珠磨等设备中获得。在高压匀浆器中,进入高压室中的细胞悬浮液被强迫通过一个狭窄的小孔，由于产生液相剪切力引起细胞破碎。在机械驱动的破碎机中,剪切力是由细胞与设备中的固体表面间的相互作用产生的,这种剪切力场之间的相互作用较复杂，目前了解得还不够深入，工程设计大多数靠经验。

1，高压匀浆器：高压浆器是用作细胞破碎的较好的设备，它是由可产生高压的正向排代泵和排出阀组成，排出阀具有狭窄的小孔，其大小可以调节。细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排出阀的小孔中冲击,并高速撞击在撞击环上，使细胞得到破碎。在操作方式上,可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式。某些较难破碎的细胞，如小球菌、链球菌、群母菌和乳酸杆菌等，以及处于生长静止期的细胞或通入的细胞浓度较高时，应采用多次循环的方式才能达到较高的破碎率

2，高速珠磨机：珠磨是另一种常用的机械破碎细胞的方法。利用玻璃小珠与细胞悬浮液一起快速搅拌,由于研磨作用,使细胞获得破碎。

3，超声波振荡器：超声波具有频率高、波长短、定向传播等特点,通常在15~25kHz的频率下操作。超声波振荡器有不同的类型,常用的为电声型,它是由发声器和换能器组成，发生器能产生高频电流，换能器的作用是把电磁振荡转换成机械振动。超声波振荡器又可分为槽式和探头直接插入介质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。超声波对细胞的破碎作用与液体中空穴的形成有关。当超声波在液体中传播时，液体中的某一小区域交替重复地产生巨大的压力和拉力。由于拉力的作用,使液体拉伸而破裂，从而出现细小的空穴。这种空穴泡在超声波的继续作用下,又迅速闭合，产生一个极为强烈的冲击波压力,由它引起的粘滞性漩涡在悬浮细胞上造成了剪切应力，促使其内部液体发生流动，而使细胞破碎。超声波处理细胞悬浮液时,破碎作用受许多因素的影响,如超声波的声强、频率、液体的温度、压强和处理时间等，此外介质的离子强度、PH值和菌种的性质等也有很大的影响。不同的菌种，用超声波处理的效果也不同,杆菌比球菌易破碎,革兰氏阴性菌细胞比革兰氏阳性菌易破碎,酵母菌效果较差。

二，非机械法

适合于破碎微生物细胞的非机械法有多种，包括化学法、酶解法、物理法和干燥法等。

1，化学法：采用化学试剂处理微生物细胞可以溶解细胞或抽提某些细胞组分。用碱处理细胞，可以溶解除去细胞壁以外的大部分组分。酸处理可以使蛋白质水解成游离氨基酸,通常采用6mol/L HCl处理。此外,某些表而活性剂(如洗涤剂)也常能引起细胞溶解或使某些组分从细胞内渗漏出来,如对胞内的异淀粉酶可加入0.1%十二烷基硫酸钠或0.4%triton X-100于菌液中,30℃振荡30小时就能较完全地将异淀粉酶抽提出来，且酶的比活较机械破碎法的高。除上述酸、碱及表面活性剂外,也可采用某些脂溶性有机溶剂,如丁醇、丙酮、氯仿等它们能溶解细胞膜上的脂质化合物,使细胞结构破坏,将胞内产物抽提出来。但是，这些溶剂容易引起生化物质破坏，使用时应考虑其稳定性，操作要在低温下进行,处理后，还必须将抽提液中的有机溶剂从生化物质中分离回收。

2，酶解法：酶解法是利用酶反应分解破坏细胞壁上特殊的键，以达到破壁的目的。酶解的方法可以在细胞悬浮液中加入特定的酶，也可采用自溶作用。应用酶解需要选择适宜的酶和酶系统，并要控制特定的反应条件，某些微生物体可能仅在生长的某一阶段或生长处于特定的情况下,对酶解才是灵敏的。有时,还需附加其他的处理，如辐射,渗透压冲击、反复冻融等或加金属整合剂 EDTA,除去与膜蛋白结合的金属离了,暴露出对酶解敏感的结构部分,也可利用生物因素以促进活性，变得对酶解作用敏感。

对于微生物细胞，常用的酶是菌酶，它能专一的分解细胞壁上糖蛋白分子的 β(1，4)糖苷键，使多糖分解,经菌酶处理后的细胞移至低渗溶液中,细胞就会破裂。例如在巨大芽抱杆菌或小球菌悬浮液中加入溶菌酶,很快就产生溶菌现象。除溶菌酶外，还可选用蛋白酶、脂肪酶、核酸酶、透明质酸酶等。

自溶作用是利用微生物自身产生的酶来溶菌，而不需外加其他的酶。在微生物代谢过程中,大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。有时改变其生长的环境，可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶,以达到自溶目的。影响自溶过程的因素有温度、时间、pH、缓冲液浓度、细胞代谢途径等。微生物细胞的自溶常采用加热法或干燥法。例如,谷氨酸产生菌，可加入0.028mol/L Na2CO3和0.018mol/L NaHCO3 pH10的缓冲液,制成3%的悬浮液,加热至70℃保温搅拌20分钟,菌体即自溶。又如酵母细胞的自溶需在45~50℃温度下保持12~24小时。

采用抑制细胞壁合成的方法能导致类似于酶解的结果。某些抗生素如青霉素或环丝氨酸等,能阻止新细胞壁物质的合成。但是抑制剂加入的时间很重要,应在发酵过程中细胞生长的后期加入，只有当抑制剂加入后,生物合成和再生还在继续进行,溶胞的条件才是有利的，因为在细胞分裂阶段，细胞壁就造成缺陷,即达到溶胞作用。

3，渗透压冲击法：先把细胞放在高渗溶液中(例如一定浓度的甘油或蔗糖溶液)由于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩,当达到平衡后,将介质快速稀释或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压发生突然变化,胞外的水分迅速渗入胞内,使细胞快速膨胀而破裂。

4，冻结-融化法：将细胞放在低温下冷冻(约-15℃),然后在室温中融化,如此反复多次，就能使细胞壁破裂。冻结-融化法破壁的机理有两方面:一方面在冷冻过程中会促使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能。另一方面,冷冻时胞内水结晶,形成冰晶粒,引起细胞膨胀而破裂。

5，干燥法：经干燥后的菌体，其细胞膜的渗透性发生变化，同时部分菌体会产生自溶，然后用丙酮、丁醇或缓冲液等溶剂处理时,胞内物质就会被抽提出来。

干燥法的操作可分空气干燥、真空干燥、喷雾干燥和冷冻干燥等。酵母菌常用空气干燥,在25~30℃的热空气流中吹干,部分酵母产生自溶,再用水,缓冲液或其他溶剂抽提时，效果就较好。真空干燥适用于细菌，把干燥成块的菌体磨碎再进行抽提。冷冻干燥适用于制备不稳定的生化物质，在冷冻条件下磨成粉，再用缓冲液抽提。

三，各种破碎方法的优劣和选择依据

由上述可见，细胞破碎的方法很多,但是它们的破碎效率和适用范围不同。其中许多方法仅适用于实验室和小规模的破碎,迄今为止,能适用于工业化的大规模破碎方法还很少，由于高压匀浆和珠磨两种机械破碎方法，处理量大,速度非常快，目前在工业生产上应用最广泛。

在机械法破碎过程中,由于消耗机械能而产生大量的热量,使料液温度升高,而易造成生化物质的破坏，这是机械法破碎中存在的共同问题，因此，在大多数情况下都要采取冷却措施，对于较小的设备,可采用冷却夹套或直接投入冰块冷却，但是在大型设备中热量的除去是必须考虑的一个主要问题。特别在超声波处理时，热量的驱散不太容易,很容易引起介质温度的迅速上升,这就限制了它的放大使用，因为要输入很高的能来提供必要的冷却,在经济上是不合算的。因此，超声波振荡法主要适用于实验室或小规模的细胞破碎。

非机械法中的化学法和酶法应用最广泛。采用化学法时，特别应注意的问题是所选择的溶剂(酸、碱、表面活性剂和有机溶剂等)对生化物质不能具有损害作用,在操作后，还必须采用常规的分离手段，从产物中除去这些试剂,以保证产品的纯净。酶解法的优点是专一性强,发生酶解的条件温和，采用该法时必须选择好特定的酶和适宜的操作条件。由于溶菌酶价格较高，一般仅适用于小规模应用。但是对于酵母细胞壁的破碎，已有应用于工业规模的报道。自溶法价格较低,在一定程度上能用于工业规模,但是，对不稳定的微生物容易引起所需蛋白质的变性，自溶后的细胞培养液过滤速度也会降低。抑制细胞壁合成的方法由于要加入抗生素，费用也很高。

渗透压冲击和冻结-融解法都属于较温和的方法，但破碎作用较弱，它们只适用于细胞壁较脆弱的微生物菌体或者细胞壁合成受抑制、强度减弱了的微生物，它们常与酶解法结合起来使用，提高破碎效果。

干燥法属于较剧烈的一种破碎方法，容易引起蛋白质或其他组分变性，当提取不稳定的生化物质时，常加入一些试剂进行保护,如可加入少量还原剂半胱氨酸、硫基乙醇、亚硫酸钠等。

选择破碎方法时,需要考虑下列因素:细胞的数量和细胞壁的强度;产物对破碎条件(温度、化学试剂、酶等)的敏感性;要达到的破碎程度及破碎所必要的速度等，具有大规模应用潜力的生化产品应选择适合于放大的破碎技术。同时还应把破碎条件和后面的提取步骤结合起来考虑。在固-液分离中，细胞碎片的大小是重要因素，太小的碎片很难分离除去，因此,破碎时既要获得高的产物释放率又不能使细胞碎片太小,如果在碎片很小的情况下才能获得高的产物释放率,这种操作条件仍不是合适的,适宜的细胞破碎条件应该从高的产物释放率、低的能耗和便于后步提取这三方面进行权衡。

为了能有效地破碎细胞，并尽川能减少产物的破坏,已发展了多种细胞破碎的方法通常可分为机械法和非机械法两类。

①，机械法

2，高速珠磨机：珠磨是另一种常用的机械破碎细胞的方法。利用玻璃小珠与细胞悬浮液一起快速搅拌,由于研磨作用,使细胞获得破碎。

②，非机械法

适合于破碎微生物细胞的非机械法有多种，包括化学法、酶解法、物理法和干燥法等。

1，化学法：采用化学试剂处理微生物细胞可以溶解细胞或抽提某些细胞组分。用碱处理细胞，可以溶解除去细胞壁以外的大部分组分。酸处理可以使蛋白质水解成游离氨基酸,通常采用6mol/L HCl处理。此外,某些表而活性剂(如洗涤剂)也常能引起细胞溶解或使某些组分从细胞内渗漏出来,如对胞内的异淀粉酶可加入0.1%十二烷基硫酸钠或0.4%triton X-100于菌液中,30℃振荡30小时就能较完全地将异淀粉酶抽提出来，且酶的比活较机械破碎法的高。除上述酸、碱及表面活性剂外,也可采用某些脂溶性有机溶剂,如丁醇、丙酮、氯仿等它们能溶解细胞膜上的脂质化合物,使细胞结构破坏,将胞内产物抽提出来。但是，这些溶剂容易引起生化物质破坏，使用时应考虑其稳定性，操作要在低温下进行,处理后，还必须将抽提液中的有机溶剂从生化物质中分离回收。

2，酶解法：酶解法是利用酶反应分解破坏细胞壁上特殊的键，以达到破壁的目的。酶解的方法可以在细胞悬浮液中加入特定的酶，也可采用自溶作用。应用酶解需要选择适宜的酶和酶系统，并要控制特定的反应条件，某些微生物体可能仅在生长的某一阶段或生长处于特定的情况下,对酶解才是灵敏的。有时,还需附加其他的处理，如辐射,渗透压冲击、反复冻融等或加金属整合剂 EDTA,除去与膜蛋白结合的金属离了,暴露出对酶解敏感的结构部分,也可利用生物因素以促进活性，变得对酶解作用敏感。

3，渗透压冲击法：先把细胞放在高渗溶液中(例如一定浓度的甘油或蔗糖溶液)由于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩,当达到平衡后,将介质快速稀释或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压发生突然变化,胞外的水分迅速渗入胞内,使细胞快速膨胀而破裂。

四，各种破碎方法的优劣和选择依据

选择破碎方法时,需要考虑下列因素:细胞的数量和细胞壁的强度;产物对破碎条件(温度、化学试剂、酶等)的敏感性;要达到的破碎程度及破碎所必要的速度等，具有大规模应用潜力的生化产品应选择适合于放大的破碎技术。同时还应把破碎条件和后面的提取步骤结合起来考虑。在固-液分离中，细胞碎片的大小是重要因素，太小的碎片很难分离除去，因此,破碎时既要获得高的产物释放率又不能使细胞碎片太小,如果在碎片很小的情况下才能获得高的产物释放率,这种操作条件仍不是合适的,适宜的细胞破碎条件应该从高的产物释放率、低的能耗和便于后步提取这三方面进行权衡。

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