大肠杆菌是制备那些不需要额外加工修饰的重组蛋白的主力军。但是，当这些蛋白在大肠杆菌宿主中大量表达时，它们往往会形成一种叫做包涵体的固体团块，这些团块状的蛋白通常是没有活性的。为了让这些蛋白恢复活性，我们需要经过一系列复杂的步骤恢复其活性，包括溶解、重新折叠和纯化。通常，我们会用一些强变性能力的的化学物质，比如尿素或盐酸胍，以及一些还原剂，比如β-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT），来溶解这些包涵体蛋白。然后，我们会慢慢去除这些化学物质，让蛋白质重新折叠，形成正确的二硫键及三维结构，恢复蛋白的活性。这个过程通常会导致蛋白质的结构发生变化，失去原有的结构，形成无规则的卷曲，并暴露出疏水部分。这种结构的丧失和变性蛋白分子间的相互作用，是导致包涵体中活性蛋白回收率低的主要原因，通常只有15-25%的总蛋白能够恢复活性。包涵体蛋白的特点主要有。 优点：①表达量高，能够大量制造重组蛋白。②包涵体的大小和密度与细胞内的其他物质不同，所以容易分离，得到纯度高的重组蛋白。③表达的蛋白不容易降解，对细胞内的蛋白酶有抵抗力，可以制造一些对细胞有毒的蛋白。缺点：①重新折叠成活性蛋白的过程很复杂，回收率低。②最佳条件很难预测。为了避免包涵体的形成，我们可以在重组蛋白的诱导表达过程中采取以下措施：①降低诱导时的温度，低温下诱导重组蛋白的产生，可以减少包涵体蛋白的产生。②在细胞密度较低时进行诱导。③降低诱导剂的浓度，比如IPTG的浓度。④加入一些帮助溶解的标签，比如GST或MBP。要纯化包涵体蛋白，我们需要经过变性和复性这两个复杂的步骤。具体的操作流程如下：第一步：准备溶液
我们需要根据目标蛋白的特性来配制不同的溶液。这里以Tris缓冲体系为例，使用8M尿素作为变性剂，PMSF为蛋白酶抑制剂。破菌液：包含25 mM Tris-HCl，300-500 mM NaCl，0.1 mM EDTA，0.1 mM PMSF，pH调整到7.5。注意，pH值需要根据目标蛋白的等电点来调整，通常与等电点相差2个单位。
包涵体洗涤液：包含25 mM Tris-HCl，300-500 mM NaCl，0.1 mM EDTA，5%甘油（使用前加入），0.1 mM PMSF（使用前加入），0.5% Triton-X100（使用前加入），pH为7.5。
包涵体变性液：包含25 mM Tris-HCl，300-500 mM NaCl，8 M尿素，0.1 mM PMSF（使用前加入），1 mM DTT或β-巯基乙醇（使用前加入），pH为7.5。
包涵体Ni柱纯化柱平衡液：包含25 mM Tris-HCl，300-500 mM NaCl，8 M尿素，0.1 mM PMSF（使用前加入），pH为7.5。
包涵体Ni柱纯化洗杂液：包含25 mM Tris-HCl，300-500 mM NaCl，8 M尿素，0.1 mM PMSF（使用前加入），以及10-50 mM咪唑，pH为7.5。
包涵体Ni柱纯化洗脱液：包含25 mM Tris-HCl，300-500 mM NaCl，8 M尿素，0.1 mM PMSF（使用前加入），以及100-500 mM咪唑。
包涵体复性液：包含25 mM Tris-HCl，500 mM NaCl，0.1 mM EDTA，0.5 M L-精氨酸，0.1 mM PMSF（使用前加入），10%甘油（使用前加入）
第二步，实验过程：
步骤1：诱导蛋白表达
①从含有重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)菌株中取出1毫升菌液，加入到100毫升的LB培养基中，并按照1:1000的比例添加相应的抗生素。②在37°C的温度下，以220 rpm的速度摇动培养，直到菌液的OD600值达到0.6到0.8（大约需要2.5到3小时）。③加入IPTG，将最终浓度调整到0.1-1 mmol/L，继续在37°C、220 rpm的条件下摇动培养4-6小时。④将培养好的菌液在4°C、8000 rpm的条件下离心10分钟，收集菌体沉淀。步骤2：菌体破碎、洗涤包涵体和变性复性
①将收集到的湿菌按1:10的比例加入破菌液中，混合均匀后，在冰水浴中超声破碎30分钟。②破碎完成后，以10000 rpm的速度离心30分钟，去除上清液（含有可溶性蛋白），保留沉淀物（即包涵体）。③使用与破菌液等体积的包涵体洗涤液，在室温下重悬包涵体(也可在冰水浴中超声破碎10~20分钟以提高洗涤效率)，再次以10000 rpm的速度离心30分钟，弃去上清液，保留沉淀物。③重复包涵体洗涤过程三次，最后一次洗涤时不需要加入0.5% Triton-X100。④向洗涤后的包涵体溶液中加入等体积的变性液，在4°C下磁力搅拌过夜，使蛋白质充分变性。步骤3：Ni柱纯化变性后的包涵体蛋白
①将过夜搅拌的变性液以10000 rpm的速度离心20分钟，保留上清液，弃去沉淀。②使用Ni填料平衡缓冲液平衡Ni柱，至少通过5个柱体积的缓冲液。③将变性后的上清液通过0.45 μm的滤器过滤后，上样至到Ni-IDA填料中，上样时注意控制流速，流速慢会提高蛋白与填料的结合，提高回收率，上样时需收集流出液以防蛋白未被填料吸附。④使用5-10倍柱体积的洗杂液进行洗杂，去除非特异性吸附的杂蛋白。⑤使用5-10倍柱体积的洗脱液进行洗脱，收集含有目的蛋白的洗脱液。⑥使用含有500 mM咪唑的洗脱液充分冲洗填料，然后用蒸馏水冲洗，最后用20%乙醇冲洗填料，保存在4°C的冰箱中。⑦使用SDS-PAGE分析洗脱液中蛋白纯化情况，并将收集含有目的蛋白的洗脱液合并，进行后续实验。步骤4：对纯化的蛋白进行复性
蛋白的纯化过程可以在室温或4°C下进行，但从复性开始，整个过程通常在4°C下进行。常用的复性方法包括稀释复性、透析复性和柱上复性。这里以稀释复性为例：根据目的蛋白的洗脱液的体积，提前准备4倍体积的包涵体复性液并预冷至4°C，使用蠕动泵以5-10秒/滴的速度将洗脱液泵入复性液中，同时使用磁力搅拌器缓慢搅拌，全程于4°C条件下过夜复性。复性完成后，正确折叠的蛋白会以可溶的形式存在于溶液中，复性失败的蛋白仍会形成沉淀，因此可使用过滤的方式将沉淀蛋白进行去除。由于复性后的蛋白溶液浓度很低，因此需要对蛋白进行浓缩，以达到期望的浓度。如果对蛋白的纯度要求较高，可以使用离子交换层析或其他层析的方法对获取的蛋白进一步的提纯。注意事项： 在整个实验过程中，条件变化不宜过于剧烈，以免导致蛋白质沉淀。如果在实验中发现蛋白质沉淀，可能需要调整溶液条件或实验步骤。如果8M尿素的增溶效果不佳，可以尝试使用6M盐酸胍作为替代。
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