固定化酶的简介及偶联方式

文摘   科学   2024-09-06 07:09   江苏  


固定化配体最广泛的应用就是催化溶液中的反应。固定化酶是生物化工中最重要的应用,其目的是重复利用成本较高的酶。由于酶的生产成本并不低,且酶在生产中会大量损失,其后期的重新纯化也实属不易,因此想方设法把酶固定在基质上,使得酶的数量在催化过程中大体保持不变。值得注意的是,酶的活性会因为固定化过程而有所下降,而固定化过程并不一定能解决酶催化剂中毒等活性下降的问题。如何将酶进行固定化是生物偶联反应领域待解决的问题。这些酶通过与偶联剂相联后可以合成一套固定化酶的系统,当样品溶液进行过滤和洗涤后,即可简单地对底物进行催化或对反应性化合物进行分离。例如固定化蛋白酶可以用于蛋白质组学分析,因为蛋白酶按照特定序列对蛋白质具有切割的特异性,从而能将特定蛋白质切割成长度不一的多肤,然后用质谱法对这些肤链进行分析并利用生物信息学的数据库进行对比,通过对肤链的分析还原蛋白质结构。如果不对蛋白酶进行固定,则会出现酶本身造成的污染。胰蛋白酶就是质谱反应前最常用的蛋白酶。

固定化蛋白酶也被用于重组表达蛋白融合标记的切割。许多融合标签在重组表达蛋白中是不需要的,应当切除。如果在表达的蛋白质和融合标签之间表达一段能够被特定蛋白酶识别的肤序列,则经过固定化酶处理便可能将其摒除。固定化蛋白酶还可以用于生物反应器,在工业生产中大有裨益。酶一般固定在微小但是不溶于水的固体载体上,通过可溶性生物偶联物的反应,将各种粒子充填进入色谱柱。这类粒子一般以无机材料为主,如二氧化硅、陶瓷材料、金属氧化物等,因为无机材料较为惰性,也有高聚物如聚苯乙烯、聚氨等。酶可以用物理方法加载到载体上,如物理吸附,但通常情况下的做法是利用聚合物结构将酶包封并黏附到固体基质上。共价反应就是生成化学键,对于酶而言一般还是利用胺或者硫醇键.物理方法对酶活性影响较小,而化学成键的影响较大,要注意控制交联度。

固定化反应器在工业领域应用的最佳例子是利用纤维素生成乙醇,这对于缓解目前的能源危机有着十分重要的意义。当今石油资源愈加紧张,利用玉米等代替石油会消耗宝贵的粮食,而人并不能消化纤维素。纤维素来源广泛,利用纤维素酶产生乙醇不消耗粮食,通过纤维素酶可将纤维素水解转化为葡萄糖并产生乙醇。纤维素酶的固定化有助于降低业化大规模生产的成本。乙醇的生产还可以用细胞进行,由于细胞十分脆弱,因此固定化细胞将有利于对细胞进行保护,而且很容易在最终产物乙醇中取出细胞。
不溶性载体偶联的脂肪酶组成的固定化生物反应器偶联物,在生物工艺操作中具有重要的用途。脂肪酶是脂肪酸酷键水解的催化剂,特别是对于可用于大规模生产油脂化学品的甘油三醋。从甘油三醋制备脂肪酸的传统化学方法必须利用高温高压,但是使用脂肪酶催化剂仅在常温常压下就可进行水解反应生产脂肪酸。该固定化反应器广泛用于化妆品工业,与标准有机合成相比,可在相对较低的温度(60C~70C)下生产特定的脂肪酸甘油酷固定化酶已经被广泛应用于有机合成过程,特别是涉及消旋产物。由于许多固定化酶不仅可以用于水溶液,也可用于有机环境,酶的活性并不受到太多影响,因此使用固定化酶作为生物催化剂越来越受欢迎。酶具有空间选择性,因此能够以对应选择性的方式识别和作用于底物,这为合成旋光性药物创造了强有力的工具,可用于生物制药。固定化反应器目前可用于工业化生产中几十种生物催化过程,如使用固定化葡萄糖异构酶生产高果糖玉米糖浆,使用固定化脂肪酶进行甘油三酷的酶交换,以及使用固定化睛水合酶生产丙烯酷胺。除了将酶反应器固定在颗粒等固相之外,酶本身也能够被交联形成不溶性颗粒,而不需要将其附着到第二载体上。通常可以加入传统的戊二醛作为交联剂来促进不溶性颗粒的形成,以形成最终的固定化反应器。如利用苯基甘氨酸酷胺和 6-氨基青霉烷酸(6-APA)交联制备不溶的青霉素 G 基转移酶以合成氨青霉素。

固定化酶反应器也广泛用于分析测定。小分子的高效液相层析(HPLC)分离可以使用固定化酶反应器对底物进行柱后检测,所述固定化酶反应器可以作用于底物并产生荧光或高吸光度产物,随后可以使用标准光谱手段进行监测。在这个应用中,酶反应器仅对分离样品中的一种成分具有特异性,它可以对那些难以分析的生物或有机分子提供高灵敏度的检测。在HPLC应用中,酶反应器通常使用氨基丙基硅烷衍生物固定在二氧化硅或可控多孔玻璃载体上,用戊二醛活化氨基丙基硅烷衍生物以使酶通过氨基附着。已经成功研发出在HPLC 系统中使用的多酶反应器,如用于生物细胞提取物中磷酸的蛋白质组分分析。首先使用固定化蛋白酶如胰蛋白酶消化通过 HPLC 的蛋白质样品,并切割成多肤,接下来将肤的混合物流过固定化的碱性磷酸酶微反应器以分析磷酸肤部分。将 HPLC 酶反应器系统加入质谱,以最终测定分离和已加工的肤。在食品工业中,这种方法最为有效,因为该方法对生化产物具有特异性,可用于分析许多小分子,如葡萄糖、果糖、半乳糖、乳酸、乙醇和氨基酸,尤其是食物中的亚硫酸盐或者药物的代谢产物。

非酶的、单反应方向的固定化反应器载体能与目标分子发生反应,并将其转化为所需的产物。在这种情况下,反应器能够与溶液中的目标分子反应,但是反应物会消耗殆尽而并非像酶一般保持原有性质。这种载体的一个例子是固定化的还原剂,可以还原目标分子以引起二硫键还原或其他还原步骤。二硫化物还原剂通常用于在溶液中还原蛋白质或肤内的半胱氨酸二硫化物。例如三(乙-羚乙基)(TCEP),特别适合还原蛋白质而不影响其他变化。含二硫键的短肤可以用固定化 TCEP 来还原,然后简单地通过滤除不溶性载体上的溶液来纯化含硫醇的胁。

其他固定化反应器用于在合成过程中进行某些有机化学转化,克服了后续纯化步骤纯化反应产物的难题。聚合物结合试剂可以预先设计结构与有机分子反应,同时可将终产物从树脂上洗脱而简单地实现分离。在某些情况下,固定化反应器能够与小分子结合,接着利用后续反应释放出来。这种将固定化的有机合成反应物商业化,包括硼氢化物和氰基硼氢化物的固相形式,用于还原基化合物、叠氮化物或类,也可用于醛或酮与胖、酷胖和氨氧基的还原氨化偶联。固定化还原剂使得反应能够在小分子上进行,而不需要复杂的纯化方案来去除还原剂。与微粒偶联的硼氢化物或氰基硼氢化物可以通过离心或过滤简单地除去,而反应产物在溶液中被收集。

此外,酷胺形成试剂能以固定化的形式将含羚酸的分子与含胺的分子结合。碳二亚胺就是这样一种试剂,可以促进两个小分子结合在一起形成酷胺键。该试剂在溶液环境下会产生副产物,必须在后续工序去除。使用固定化的碳二亚胺,通过简单的去除和载体的清洗就可以从所需的偶联物中除去碳二亚胺和异脉等副产物。该反应通常在CHCI和DMF中进行,还可用于由含羚酸盐的分子生成反应性醋。

固定化反应器可以酶催化剂或小的活性分子的形式用于实现许多化学反应,由于具有易于分离副产物的特性,因此很多困难的多步反应可以持续不断地进行。这种特性使得这些固定化的偶联物试剂目前能用于各种应用,规模从实验室反应到大型工业化生产,尤其是在大型工业生产中有利于反应持续进行,有利于积累产物以及对产物进行快速检测。工业化生产将可以用现代化的控制手段进行正负反馈管理。这些固定化偶联的应用在许多学科中成为常规的步骤和手段,尤其是生物医学以及生物化工领域。生物偶联物在各学科的优势也愈加明显,其使用的场合和频率也将继续增加。

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