急性肾损伤（AKI）是常见临床综合征，肾功能短时间内快速下降，全球年约1330万人受累。其病因有肾前性（如脱水、休克等）、肾性（如急性肾小管坏死等）、肾后性（如尿路梗阻）。对比剂所致AKI（CI-AKI）在使用对比剂患者中发生率超30%，老人及肾病患者风险高。对比剂干扰肾小管线粒体功能致氧化应激，损伤、凋亡肾小管细胞，还激活CREB1/Arg-2轴，加重氧化应激、炎症与凋亡。当前，传统液体疗法及N-乙酰半胱氨酸等药物对CI-AKI疗效欠佳。
中南大学湘雅三医院左笑丛教授与南开大学Adam C. Midgley副教授课题组提出，用小干扰RNA（siRNA）抑制Arg-2表达缓解对比剂致急性肾损伤（CI-AKI），但siRNA体内摄取效率低且有安全隐患。研究团队先选生物相容性、降解性佳的壳聚糖（CS）为载体提高递送效率，可其与siRNA形成的离子凝胶不规则，体内循环半衰期短，遂改用聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）为基础材料。
图1 PLGA/CS/HA-KTP siRNA的设计与合成PLGA/CS/HA-KTP siRNA纳米颗粒的设计原理如图1所示：首先，PLGA纳米颗粒通过双重乳化法制备，包裹近红外荧光染料Cy5以实现追踪。然后，纳米颗粒表面吸附带正电的壳聚糖（CS），通过静电作用和离子凝胶形成包裹siRNA。接着，带负电的透明质酸（HA）作为外层涂层，以减少非特异性吸附和免疫反应，延长体内循环时间。最后，将肾脏靶向肽KTP连接到HA外层，使其与肾小管细胞表面的megalin受体结合，实现肾脏定向传递。
图2 PLGA/CS/HA-KTP siRNA的相关表征结果课题组通过琼脂糖凝胶电泳检测PLGA/CS/HA-KTP siRNA的siRNA包载效率，结果显示三层LbL组装后siRNA条带消失，负载效率达约98%±0.9%（图2B）。动态光散射（DLS）测定表明，纳米颗粒在LbL组装过程中粒径增加、ζ电位反转，三层LbL后粒径为306 nm，ζ电位接近中性，平均干态粒径为90.68±10.04 nm，具有良好的亲水性（图2C-D）。此外，琼脂糖凝胶电泳验证纳米颗粒可保护siRNA免受RNA酶降解，仅在同时存在CS和HA酶时siRNA才完全释放（图2E-F）。![]()
图3 PLGA/CS/HA-KTP siRNA的细胞内摄取及溶酶体逃逸特性
为了研究PLGA/CS/HA-KTP siRNA的细胞内特性，研究人员首先通过标记Cy-5研究纳米颗粒在HK-2细胞中的摄取情况，发现PLGA/CS/HA-KTP siRNA的细胞内荧光最强，其通过巨膜蛋白介导的内吞作用进入细胞，且KTP修饰增强了细胞内化（图3A）。接着课题组使用流式细胞术定量荧光强度证实了PLGA/CS/HA-KTP siRNA的转染效率接近70%（图3B）。最后，展示了siRNA的溶酶体逃逸过程：PLGA/CS/HA-KTP siRNA进入细胞后，通过质子海绵效应从溶酶体逃逸，释放siRNA进入细胞质，实现对靶基因的抑制（图3C-E）。
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图4 PLGA/CS/HA-KTP siRNA对HK-2细胞氧化应激和线粒体功能的影响
课题组在碘海醇诱导的AKI细胞模型中验证了PLGA/CS/HA-KTP siRNA对HK-2细胞的保护作用。结果显示，该siRNA显著逆转了碘海醇引起的Arg-2蛋白表达增加和细胞活力下降（图4A-B），降低了细胞内活性氮氧化物（RNOS）荧光强度，恢复了超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）水平，降低了丙二醛（MDA）水平（图4C），并恢复了线粒体膜电位，逆转了线粒体通透性转换孔（mPTP）的过度开放，提高了细胞内三磷酸腺苷（ATP）水平(图4D-H）。![]()
图5 PLGA/CS/HA-KTP siRNA的体内生物分布课题组通过尾静脉注射Cy-5标记的PLGA/CS/HA-KTP siRNA纳米颗粒，对小鼠进行活体成像，发现该纳米颗粒在肾脏中的荧光信号最强，12 h达到峰值，24 h仍可检测到，表明KTP修饰显著增强了其在肾脏的靶向性和滞留能力（图5A）。体外成像进一步证实了纳米颗粒在肾脏中的强荧光信号及其随时间变化的趋势（图5B）。免疫荧光分析显示，纳米颗粒主要分布在肾小管上皮细胞，与巨膜蛋白受体共定位，而在肾小球中几乎无分布，进一步证明了其高肾小管特异性和肾靶向性，与KTP修饰对巨膜蛋白受体的亲和性相关（图5E）。图6 PLGA/CS/HA-KTP siRNA对CI-AKI小鼠的体内治疗效果
文献详细展示了CI-AKI小鼠模型的构建及纳米颗粒干预流程，包括肾切除、脱水、药物注射及样本采集等关键步骤，为体内实验提供了标准化操作框架，确保结果可靠性和可比性（图6A）。在CI-AKI小鼠模型中，PLGA/CS/HA-KTP siRNA预注射显著逆转了血清肌酐和尿素氮的升高，并改善了碘海醇导致的小鼠少尿症状，增加了尿量，表明其对肾脏尿液生成和排泄功能具有调节作用（图6B-D）。HE和PAS染色结果显示，该纳米颗粒预注射显著减轻了碘海醇诱导的肾小管上皮细胞病理异常（图6E-F）。
总体而言，研究团队开发了一种通过Magelin受体靶向肾脏的纳米颗粒PLGA/CS/HA-KTP siRNA ，通过沉默Arg-2基因，激活Nrf-2/HO-1轴，成功减轻了氧化应激、硝化应激和细胞凋亡，改善了肾脏功能，提供了一种有效预防和治疗CI-AKI的新策略。
1. 开发了一种通过Magelin受体靶向肾脏的纳米颗粒PLGA/CS/HA-KTP
siRNA，用于对比剂引起的急性肾损伤的治疗。2. 通过层层自组装LbL的设计，显著提高了siRNA的递送效率。1. 本文版权归原作者所有，公众号和媒体转载请与我们联系！2. 因学识有限，难免有所疏漏和谬误，恳请批评指正！3. 本文主要参考以下文献，仅用于对相关科学研究的介绍、评论或课堂教学，不得作为商业用途。如有任何版权问题，请随时与我们联系！Gu X, Tai Y, Liu Z, et al. Layer‐by‐Layer Assembly of Renal‐Targeted Polymeric Nanoparticles for Robust Arginase‐2 Knockdown and Contrast‐Induced Acute Kidney Injury Prevention[J]. Advanced Healthcare Materials, 2024, 13(20): 2304675.
