抗体-药物偶联物(ADCs)在临床应用中存在靶点有限、副作用大等问题，T细胞免疫治疗也受困于免疫逃逸导致的复发情况。先天免疫对肿瘤治疗至关重要，而基于寡核苷酸的适配体技术的发展为肿瘤靶向治疗带来新契机。
本研究旨在基于DNA模板聚合反应开发一系列可编程适配体的多特异性衔接偶联物，即环状单链多价适配体-药物偶联物(os-mvApDCs)，以实现递送治疗过程中广泛增强先天和适应性免疫抗肿瘤的效果，为癌症患者带来更有效的治疗新希望(图1)。
图1 总览图
首先，团队选择了多种肿瘤相关适配体(如SL1-c-Met、Sgc8c-PTK7等)，将不同药物模块(如MMAE、T785、diABZI)通过DBCO-叠氮点击反应连接到适配体环上，再将适配体序列、支架链和T4 DNA连接酶按配比混合，经核酸外切酶处理去除末端底物和副产物，合成了os-mvApDCs(图2)。
图2 os-mvApDCs的合成
通过凝胶电泳、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI - TOF)、动态光散射(DLS)、圆二色谱(CD)、冷冻电镜(Cryo - EM)的系列手段，表征了不同价态、种类和大小的os-mvApts和os-mvApDCs，并验证了其良好的血清稳定性(图3)。
图3 os-mvApDCs的表征
随后，以MKN45细胞(c-Met过表达)为模型，研究了os-mvApDCs胞内靶向识别与多受体介导的内吞作用，发现Cy5标记的多价os - mvApts在与细胞共孵育后，相较单价SL1适配体，内化更明显(图4a)，且三价os-mvApts摄取效率最高(图4b)，主要通过巨胞饮/小窝蛋白依赖的多受体介导的内吞作用进入细胞(图c,d)。免疫激活研究发现，偶联diABZI和T785的os - mvApDCs分别可激活cGAS - STING和TLR7/8通路，促进THP-1和DC2.4细胞成熟，产生高水平的IFN-β。同时，三价3SlosmvApDCsSMT能有效促进细胞死亡，且毒性低于高浓度的激动剂单独作用(图4e-g)。
图4 os-mvApDCs靶向识别与多受体介导的内吞及免疫激活作用研究
进一步，通过尾静脉注射荧光标记的os – mvApts到荷瘤裸鼠体内，追踪其生物分布。结果显示，与线性相比，os – mvApts在血液中暴露时间延长，肿瘤摄取增加(图5a, b)。具体地，3SlosmvApDCsSMT对肿瘤抑制率可达90%，延长小鼠存活时间至45天以上，且免疫组化显示其抑制肿瘤细胞增殖效果显著优于单药治疗(图5c, d)。此外，该制剂还能提高肿瘤组织中M1/M2巨噬细胞比例，促进M2向M1极化，增强抗肿瘤免疫(图5e)。
图5 多价适配体平台体内抗肿瘤效果评价
后续，研究人员设计了靶向PD-1(T细胞)、PD - L1和c - Met(肿瘤细胞)的三特异性适配体-药物偶联物Sl/Pd/MjosmvApDCsSMT，发现其选择性结合小鼠肿瘤KPC或T细胞，增强细胞间相互作用(图6a-c)，且仅对肿瘤细胞毒性强(EC50为1.4 nM)，对幼稚T细胞和骨髓来源树突状细胞(BMDCs)毒性低(图6d-f)。在动物水平，Sl/Pd/MjosmvApDCsSMT与无药物和非靶乱序偶联物药物相比，其在肿瘤细胞中积累更高，注射后1天可使T细胞浸润增加6倍，表明适配体-药物偶联物促进T细胞向肿瘤微环境招募，协同抑制肿瘤生长(图6g-j)。
图6 Sl/Pd/MjosmvApDCsSMT增强T细胞向肿瘤的募集
最后，由于肿瘤细胞会上调PD - L1表达，诱导T细胞耗竭和功能失调，营造免疫抑制环境以逃避免疫监视；因此，研究在上述基础上，选择了PD - 1抗体(αPD - 1)与偶联物联合治疗荷KPC肿瘤的C57BL/6小鼠，在特定时间点进行免疫分析，包括肿瘤微环境(TME)和引流淋巴结(dLNs)中的免疫细胞频率和表型分析。结果显示，联合治疗诱导强大且持久的抗肿瘤效果，8只小鼠中有2只完全缓解，存活时间超过60天。联合治疗显著降低TME中髓源性抑制细胞(MDSCs)、调节性T细胞(Tregs)频率，促进巨噬细胞M2 - M1再极化，激活dLNs中的树突状细胞成熟，产生高水平的促炎细胞因子，增强T细胞功能，减少T细胞耗竭，同时扩大记忆性T细胞亚群。表明联合治疗通过有效递送药物和激活免疫通路，逆转免疫抑制微环境，增强肿瘤清除(图7、8)。
图7 Sl/Pd/MjosmvApDCsSMT增强天然免疫
图8 通过T细胞接合和检查点阻断增强CD8+ T细胞应答
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