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Vero α-卫星 qPCR 验证
对于含有极低水平 rcDNA 的高度纯化疫苗，定量rcDNA杂质的最合适阶段是配制前浓缩的纯化阶段，即原液。进行了三种疫苗的原液上的验证：采用 RMAOfree 工艺生产的狂犬病疫苗、登革热疫苗和 IPV。无 RMAO 工艺生产的狂犬病疫苗的 rcDNA 标准为 ≤666 pg/mL（相当于 ≤100 pg/剂）。对于登革热疫苗，原液阶段的 rcDNA 规格≤330 pg/mL（相当于≤100 pg/剂），IPV 原液阶段的rcDNA 规格≤1000 pg/mL（相当于≤ 100 pg/剂）。
采用无 RMAO 工艺生产的狂犬病疫苗：该方法在 0.40 –1084 pg/mL 范围内具有特异性和线性，并且在相同范围内具有准确性，回收率为 77 –90%。该方法非常精确，一次运行的重复性和中间精密度的置信区间 (CI) 为 95%分别等于 x/÷ 1.28 和x/÷ 1.46。定量限 (LOQ) 定义为 0.40 pg/mL。一次测量且一次运行的 LOQ 为 0.40 pg/mL 时，中间精密度的 95% CI 等于 x/÷ 1.58。
登革热疫苗：该方法在 0.50 –652 pg/mL 范围内具有特异性和线性，在相同范围内具有准确性，回收率为 83 –104%。该方法非常精确，一次运行的重复性和中间精密度为 95% CI分别等于 x/÷ 1.42 和 x/÷ 1.60。LOQ 定义为0.50 pg/mL。一次测量且一次运行的 LOQ 为0.50 pg/mL 时，中间精密度的 95% CI 等于x/÷ 1.99。
灭活脊髓灰质炎病毒疫苗：该方法在0.60 –1743 pg/mL 范围内具有特异性和线性，在相同范围内具有准确性，回收率为 94 –128%。该方法非常精确，一次运行的重复性和中间精密度为 95% CI分别等于 x/÷ 1.30 和 x/÷ 1.57。LOQ 定义为0.60 pg/mL。一次测量且一次运行的 LOQ 为0.60 pg/mL 时，中间精密度的 95% CI 等于x/÷ 1.41。
Threshold ® 测定被认为在 230 –1840 pg/mL 范围内具有特异性和线性，并且在相同范围内具有准确性，平均回收率为 95%（表 3）。该方法非常精确，两次运行的重复性和中间精密度为 95% CI分别等于 x/÷ 1.21 和 x/÷ 1.20。LOQ 定义为230 pg/mL。对于一次测量的两次独立运行，LOQ 为230 pg/mL 时的中间精密度的 95% CI 等于x/÷ 1.31。
比较了通过 Threshold ® 检测获得的 IPV 验证结果与通过 Vero α-卫星 qPCR 获得的结果。两种检测的线性域上限在相似水平上得到验证，但 qPCR 的下限比 Threshold ® 检测低得多（约低 400 倍）。
总结了使用三种 DNA 定量检测法测量的三种竞争对手的狂犬病疫苗与一批 VERORAB ® 狂犬病疫苗中 rcDNA 含量的比较。
这些结果显示，测定的 rcDNA 数量可能受到所用分析方法的影响；在竞争对手的五种疫苗中的三种中，qPCR 似乎测量到比 Threshold® 测定更高的 rcDNA 含量。在竞争对手的五种疫苗中有四种中，qPCR 测量到的 rcDNA 高于杂交测定，对于竞争对手的第五种疫苗，结果具有可比性。比较大小分布时，据报道，竞争对手的一种疫苗具有 407 和 620 bp 的rcDNA 片段。赛诺菲巴斯德狂犬病疫苗被发现含有 59-240 bp 的 rcDNA 片段，其中 81% 的rcDNA 小于 108 bp。
用 BPL 灭活Vero 细胞狂犬病疫苗 (VERORAB®) 导致 rcDNA 含量平均减少 30%（表5）。BPL 灭活可导致 240 bp 或更大片段的 rcDNA 含量显著降低；
收获物 H2 和 H3 中 108 bp 或更大片段的rcDNA 含量减少了 50% 以上（表 6）。
同样，对于赛诺菲巴斯德的 Vero 细胞无 RMAO 狂犬病疫苗，用 BPL 灭活导致 rcDNA 含量平均减少 46%（表7）。
本篇文献比较了对 Vero 细胞生产的病毒疫苗中 rcDNA 进行定量的内部检测方法的性能。将 Vero α-卫星序列 qPCR 与杂交和 Threshold® 检测在特异性、灵敏度和精确度方面进行了比较。还评估了疫苗生产过程中用 β-丙内酯 (BPL) 灭活病毒对rcDNA 的影响。结果显示所测量的 rcDNA 的数量受到所使用的分析方法的影响。Vero 细胞 DNA 特异性qPCR 检测结果显示，其稳定性强，动态范围大，并且对一系列产品没有基质干扰。与杂交和 Threshold® 方法相比，qPCR 检测显示出更高的灵敏度和特异性。Vero α-卫星序列 qPCR 是一种特异性且灵敏的方法，用于评估高纯度疫苗中 Vero rcDNA 含量。
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