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介绍
使用哺乳动物细胞培养的生物制药企业必须制定适当的流程，以最大限度地减少其产品被病毒污染的可能性。监管机构提供了检测策略和最佳实践指南，以确保原材料安全和生产过程的控制。安全保证依赖于相互依存的管理风险矩阵，包括原材料的表征和控制、工艺中间体的检测以及纯化单元操作的病毒去除能力的证明
大多数下游工艺中的一个专用组件是小病毒过滤器，基于大小排阻来降低工艺流中细小病毒和较大病毒的水平。近年来，人们对小型病毒过滤器去除细小病毒水平的期望有所提高，这既是因为这些过滤器性能的改进，也是因为行业期望各个单元操作的病毒清除水平更高。业界对稳健的小病毒清除步骤的期望是至少四个log。
在任何工艺中，小病毒过滤器的性能通常在缩小模型的研究中进行评估，该研究使用病毒截留膜、工艺材料、缓冲液和代表生产规模工艺的操作条件。监管文件强调，缩小模型必须尽可能地代表生产工艺。缩小规模的研究通常使用 MVM（鼠细小病毒）挑战病毒过滤器，这是一种 18-24 nm 的小病毒，对化学处理具有高度抵抗力。MVM 通常是首选模型，因为它的小尺寸使得通过尺寸排阻的去除特别具有挑战性。此外，关于生物反应器中 MVM 污染的几份报告已将其归类为过滤研究的“相关”模式病毒。
标准的大规模工艺包括将工艺中间体上样病毒过滤器，处理上样，并将缓冲液上样到病毒过滤器以进行产品回收。这些步骤如何执行的细节取决于生产企业的偏好和生产车间的限制。图 1 显示了可以供应病毒过滤单元的一些替代缓冲液和工艺中间配置的示意图。
在使用袋子或罐将工艺中间体转移到病毒过滤器或从病毒过滤器转移出来的大规模生产操作中，工艺中断很常见。将工艺中间体储存在多个袋子中需要在袋子断开连接并重新连接到泵时中断工艺。或者，工艺中断可能是非计划事件的结果，例如停电或激活紧急系统停止。此外，许多大规模操作通常在过滤运行结束时包含缓冲液冲洗步骤，以最大限度地提高收率。在这种情况下，在缓冲液转移到装载罐的过程中压力和流速会暂时停止。冲洗的材料通常与滤液收集在同一容器中。尽管可以通过多个工艺中间体的转移，或工艺中间体转移到缓冲液之间的无缝传输来防止中断，但这并不总是可能的。
2011 年，Asper 展示了一项清除研究的结果，其中包括多次工艺中断，并表明一些小病毒过滤器的病毒截留性能在这些中断后受到损害。许多小规模的病毒清除研究不包括计划外的工艺中断，也没有专门评估过滤过程中工艺中断的影响，无论是在多个工艺中间上样之间还是过渡到缓冲液冲洗之间。因此，如果验证研究不能准确代表生产工艺，则可能无法确保大规模验证的 LRV。此处描述的研究，展示了工艺中断如何影响使用一组四种不同工艺中间体的两个不同小病毒过滤器的 MVM 清除。结果表明，工艺中断减少了某些类型的病毒过滤器的病毒截留，并建议在设计缩小模型研究时考虑这一点。理想情况下，此类研究包括制造规模的计划工艺中断，而单独的研究包括计划外暂停对对数减少值 (LRV) 的影响。最终，主要动机是更好地理解和控制过滤工艺，从而确保经过验证的小病毒过滤器 LRV 也适用于生产规模，并确保已知的病毒安全水平。
实验材料和取样
本次实验使用的材料列表如下：
本次实验的取样以及实验设计下图：
结果与讨论
病毒过滤器载量和通量性能
图 3 说明了在运行中工艺中断对 Viresolve Pro 过滤器上一个工艺中间体的载量和相对通量的影响。在重新加压和继续运行之前，将最大操作压力 (50 psi) 降低至 0 psi 10 分钟。在运行结束时，在产品回收步骤之前重复中断。
对于每个预过滤的工艺中间体，未加标的基线运行显示 Viresolve Pro 设备上的堵塞最少。此外，添加病毒对通量没有明显影响，在两个病毒过滤器的重复运行之间观察到相似的曲线。所有运行都超过了最大目标通量。图 4（MAb 1 和 MAb 2）和图 5（MAb 3 和 Fc-融合）显示了所有运行的病毒过滤器载量性能，根据相对通量 (J/Jo) 相对于达到的最大体积通量百分比。左侧显示 Viresolve Pro 过滤器结果，面板显示 VF2 结果。
病毒过滤器 MVM 的log10去除性能
图 6 显示了本研究的病毒减少结果。我们观察到 Viresolve Pro（Fc-fusion，图 6，右下）和VF2 （MAb 2，图 6，右上）重复装置之间的截留差异。此外，尽管通量曲线相似，但每种工艺中间体在两种设备类型上的病毒截留曲线不同。MAb 1 在两种设备上的表现都非常好：在滤液池中未检测到病毒或检测到低水平的病毒。相比之下，Fc 融合显示两种设备的滤液中的病毒通过增加。由于过滤器污染极小（图 5，下图），因此了解这种病毒通过率增加的原因需要进一步研究。
总体而言，中断前所有工艺中间体的两种设备的病毒减少水平至少为 4 LRV（第 1 组分样本）。然而，在第一次暂停后，两种设备类型之间的截留率存在显著差异：使用Viresolve Pro 过滤器，我们看到四种工艺中间体中的三种具有强大的 MVM 截留率，并且在滤液中检测到很少的病毒，并且LRV至少五个。对于 Fc 融合，我们看到了更多的病毒穿透，但计算出的 LRV 仍高于四（第 2 组分）。通过分析来自 MAb 1 和 MAb 2 运行的随机样本（LRV 分别为 6.8 和 6.7，数据未显示）证实了加压后不会有大量病毒穿透。相比之下，在第一个工艺暂停后，我们看到四个工艺流中的三个使用 VF2 的病毒穿透显著增加，导致在某些情况下减少水平低于四。
图 7 更清楚地说明了工艺中断对VF2 设备的 MVM 截留的负面影响。在这里，截留的变化表示为每次工艺中断后重复设备的 LRV 平均变化 (ΔLRV)：ΔLRV组分 1–2 表示组分 2 和组分 1 的平均 LRV 之间的差异，以及 ∆ LRV 组分 2–3 是组分 3（产品回收）和组分 2 之间的差值。对于 Viresolve Pro 设备，在任何工艺流（ΔLRV 组分 1-2）中，在工艺中断暂停后截留没有显著变化。相比之下，对于 VF2 设备，在中断的三个测试工艺中间体的过滤中，病毒通过增加（可从大的 –ΔLRV 组分 1-2 值说明）。然而，在第二次工艺中断后，工艺中断对截留的负面影响较小（组分 2-3中的 ΔLRV）。
根据两种病毒过滤器设备类型的中断测试运行结果，出现了通用的性能模式。对于测试的四种进料中的三种，在 Viresolve Pro 设备上，在所有测试的组分中获得了至少 6 的计算 LRV。相比之下，在 VF2 设备上，在相同的挑战条件下，仅在一种进料中观察到高水平的病毒去除。表 3 总结了最终的病毒过滤器log10去除性能。
讨论
总的来说，这项研究的结果表明，Viresolve Pro 过滤器为各种工艺流提供了更高的病毒截留能力，并证明工艺中断对病毒截留性能的影响最小。相比之下，工艺中断对 VF2 设备上的病毒截留有显著影响，尽管影响程度取决于工艺中间体。
VF2 设备工艺中断的后果是过滤器截留病毒的能力会暂时降低。这种性能改变的潜在机制尚不清楚，但我们的假设是它与孔径分布、病毒过滤器的形态以及工艺中断时病毒在病毒过滤器基质中的位置有关。在中断点之前，病毒在过滤器表面的位置由施加压力产生的对流驱动。
在工艺暂停点，对流停止，病毒可以从最初截留的点扩散开。恢复工艺并重新施加压力使截留的病毒有第二次机会找到通过过滤器的路径。如果孔径分布中的一些孔不限制通过，则病毒可以通过到过滤装置的下游侧。如果将病毒过滤器的孔径分布控制为小于病毒颗粒的尺寸，并且如果孔结构的形态限制病毒的横向移动，则病毒通过工艺中断的可能性会降低。未来的研究将证明我们的假设。
准确的病毒清除设计的价值增加了我们对工艺中断对两种不同的小病毒过滤器上病毒截留的影响的理解。在旨在模拟大规模生产工艺中可能发生的工艺中断的研究中，使用四种工艺中间体对行业中广泛使用的两种过滤器进行了评估。尽管中断对两种病毒过滤器类型上所有四种工艺中间体的通量分布影响很小，但工艺中断对 VF2 设备的病毒截留产生了深远影响，该设备性能似乎依赖于工艺中间体。
总的来说，这项研究的结果表明，工艺中断可能会减少病毒截留，并且某些类型的过滤器比其他类型的过滤器更容易受到这种影响。这些数据印证了先前报告的结果，并加强了准确设计病毒清除研究以反映生产规模过程的价值，不仅在通量方面，而且在工艺流体流动和处理方面。确保药品安全的最佳方法是使用更精确的缩小模型，其中包括对实现的 LRV 至关重要的所有参数，以便小规模验证的 LRV 准确预测并直接适用于生产规模。
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