清洁验证在生物制药生产设备降低产品污染方面扮演了一个重要的角色。清洁验证证明了清洁工艺能够充分的并始终如一的从清洗的设备/系统上去除产品残留、工艺残留和环境污染,以保证该设备/系统可以安全的应用到后续产品(可能是同一种产品或是不同的产品)的生产中。
清洁验证的生命周期方法
该如何正确的进行清洁验证呢?
FDA在2011年发布了《行业指南-工艺验证:一般原则与实践》,在工艺验证活动中引入了生命周期的方法,将工艺验证分为工艺开发、工艺性能确认和持续工艺确认三个阶段。同样的生命周期理念也被引入了清洁验证的实践活动中[1]。
PDA技术报告29(2012年)《清洁验证考虑要点》中更新了清洁验证的生命周期方法,将清洁验证分为了清洁工艺开发与设计、清洁工艺验证/确认和验证状态的维护(现在也称为,持续清洁工艺确认)三个阶段,分别对应了工艺验证的三个阶段[2]。
后续,清洁验证的生命周期方法在PDA技术报告49《生物技术产品清洁验证的考虑要点》[3]、2020年ISPE的《清洁验证生命周期-应用、方法和控制》[4]以及WHO和APIC的清洁验证指南中被引入,并且逐渐完善。
图1:清洁验证的生命周期方法及每个阶段的活动内容(图片来源ISPE 2020 清洁验证生命周期方法)[4]
简单来讲,清洁工艺的开发和设计就是在实验室中对清洁工艺进行的研究和评价,确认清洁工艺的CQA和CPP,即清洁工艺的输入和输出,这个过程中需要考虑污染物的表征、车间设备和设计、清洁工艺的开发实验(包括清洁剂、工艺参数以及它们之间的相互作用)、清洁工艺的放大等。可以考虑应用工艺表征中的“设计空间”概念。清洁工艺开发和设计中最为重要的内容则是清洁取样方法、分析检测方法以及可接受限值的确定[3]。
清洁工艺验证/确认则是传统的3批次清洁验证运行,在这个过程中证明前面开发和设计的清洁工艺在商业化规模的生产上是有效且稳定的。持续清洁工艺确认则是制定后续的监控方案,进行清洁工艺的定期监控和趋势分析,以及制定清洁变更控制策略,最终确保清洁工艺在一个受控的状态下运行[3]。
ISPE《清洁验证生命周期-应用、方法和控制》(2020)中对比了工艺验证与清洁验证生命周期方法三个阶段的内容,总结如下:
表1:工艺验证与清洁验证的生命周期阶段对比[4]
如果细细推敲清洁验证的生命周期方法,不难发现清洁验证的核心是清洁工艺的开发和设计,可这也是大多数制药企业,包括生物制药企业所欠缺的工作。相比于清洁工艺的开发和与设计,大多数制药企业更愿意在产品生产工艺的开发和设计上投入时间和精力。
我们可能会基于质量源于设计(QBD)的理念去研究工艺参数对工艺输出的影响,包括进行风险评估、实验设计(DoE),以期建立设计空间。而对于清洁工艺,基本很难进行相关的实验室规模的实验,因此也很难提供更多的清洁工艺相关信息,这也是后面清洁验证失败的主要原因之一[5]。
仔细阅读EU GMP和中国GMP,其中描述到清洁工艺的目的是去除污染物,防止污染和交叉污染。清洁工艺验证的目的则是证明清洁工艺的有效性和持续性,证明清洁工艺可以将共用设备中的污染物清洁至预定的可接受限值,以防止污染和交叉污染。
基于该描述,可以发现清洁工艺开发和设计中的关键主题不外乎这几个:污染物、设备、清洁工艺、可接受限值。为了确定是否达到了可接受限值,还需要设定相应的取样方法和分析方法。
下面我们将围绕这几个关键主题讨论一下生物制药清洁工艺开发和设计的考虑要点:
污染物
首先,我们要考虑清楚清洁过程中需要去除的污染物是什么?
在生物制药生产中,接触工艺设备表面的物质有很多种,包括发酵和细胞培养基,细胞及其代谢产物,比如蛋白质和核酸;有机和无机酸,盐;工艺添加剂,如抗生素,表面活性剂,乙二醇,糖类,或动物水解产物和清洁剂,如去垢剂,酸,碱等。除此之外,还需要考虑对微生物限度和内毒素控制的需求[6]。
需要注意的是,在生物制药的生产中,清洁工艺和清洁验证的一个关键问题是活性蛋白在清洁过程中会发生降解或者失活,这是因为清洁过程中使用了热水、酸或碱的清洁剂。活性蛋白的降解和失活会影响污染物可接受限度的计算以及分析方法的选择。
清洁工艺和清洁验证的设计和分析检测必须考虑各种潜在的污物。在清洁工艺的开发及验证过程中,通过对污物的分类并选择具有代表性的污物进展检测和追溯,可以简化清洁工艺及清洁验证的工作。工艺中代表性污染物的最终确定则主要依据污染物的理化性质的相似性。
设备(设计)
清洁工艺开发和设计中考虑更多的是共用设备。简单来讲,设备(设计)方面需要考虑的因素主要包括[7]:
材质:设备材质会影响设备表面与产品之间的相互作用,从而影响设备的可清洁性。可以在实验室中使用相同材质的小型设备表面来进行模拟测试和研究。理论上,每种材质都应进行相应的研究,不过如果基于已有知识和风险评估来确定出最难清洁的材质表面进行实验,也是可接受的。通常不锈钢表面是最常见的选择,选择非电抛光不锈钢表面可作为最差条件的选择,更适合进行实验室的研究和评估。
清洁功能:设备是否具有在线清洁(CIP)功能,还是需要进行离线清洁(COP)?如果具有CIP功能,是集中CIP系统还是独立CIP系统?了解设备的功能对于清洁工艺的开发和设计非常重要,可以避免转移到商业化生产车间后需要重新开发清洁工艺的风险。
结构与设计:清洁工艺开发和设计过程中需要考虑设备是否存在死角或者污染物累积区域,如果存在,应着重考虑这些区域的清洁,必要时需要开发单独的清洁工艺或程序。
清洁工艺
清洁工艺的开发和设计通常首先在实验室内进行初步的研究,可以选择代表性(最差条件)的污染物和工艺设备表面试样进行可清洁性测试。该研究可以试图搞清楚多个主题,包括:
污染物和设备表面之间的相互作用和程度
清洁剂和污染物之间的相互作用
不同清洁条件的比较,比如清洁剂浓度、清洁时间、温度等
确定清洁工艺的步骤组成及其组合
如果涉及的清洁参数较多,可以使用风险分析工具,比如失败模式与效应分析(FMEA)对清洁工艺参数进行风险排序。研究中可使用单因子实验法或实验设计(DoE)方法。使用DoE方法可以减少研究的实验次数,还可以提供有关工艺参数之间相互作用的信息。基于DoE的研究可以支持建立清洁工艺的设计空间。
在任何情况下,重要的是实验室中的清洁工艺性能应能够代表了中试水平或商业化规模工艺的性能。随着从实验室的开发工作中选择好清洁剂和清洁条件(如温度、接触时间、清洁剂的浓度和工艺流体力学),清洁工艺需要在更大规模的工艺设备上实施。在工艺放大阶段可以基于车间经验和实验室开发研究的基础进行清洁工艺条件的调整。
可接受限值
清洁验证的目的是证明清洁工艺的有效性和一致性,达到将污染物完全去除的零风险是不现实的,通常需要设定一个可接受的合理标准,即清洁工艺的污染物残留可接受限值。
清洁工艺的可接受限值一般包含与活性成分 (或者其他的主要物质成分) 相关的、 与清洁剂相关的、与微生物负荷水平相关的、与内毒素水平相关的,以及设备目视清洁相关的要求。
与活性成分相关的可接受限值
常见的活性蛋白相关可接受限值的计算方法包括[2]:
基于剂量,即活性成分可接受残留定为已清洁产品活性成分最小日剂量占下一产品最大日剂量的千分之一,这是按照杂质残留标准进行的控制。当存在多个下一产品时,应选择最严格的一个,即日服用剂量最大的产品。
基于毒性,有两种计算方法,一种是基于可接受日暴露量(ADE)来计算,另一种是基于半数致死量(LD50)计算无可见作用水平(NOEL)进而来计算可接受限值。前者可适用于计算活性成分、中间体及其降解产物的残留,而后者更适合清洁剂的残留计算。
默认值(10ppm),基于其他计算方法计算出的可接受限值与10ppm进行比较,当10ppm更严格时,可选择默认值10ppm的计算方法。从法规角度来看,10ppm并非是认可的法规方法,只是一种更严格的整数计算方法而已。
使用基于健康的暴露限度(HBEL),EMA在2015年发布了有关HBEL的指南后,几乎所有的相关指南,包括WHO、APIC、CFDI以及PIC/S GMP指南都进行了更新,推荐优先使用HBEL的计算方法。在EMA给出的定义中,HBEL可用每日允许接触量(PDE)来替代,并给出了常用的PDE计算公式。
对于生物制药产品,制剂和最终成品中的活性成分可接受限值可以使用上述计算方法进行计算。虽然活性成分可能会发生降解,但是计算是基于活性成分的含量,这代表了计算的最差条件。可以选择计算得到的最严格的限值,该限值乘以下一产品的最小批次量即可得出上一产品活性成分的最大所允许残留量。然后计算出所有的设备的共用面积,即可算出单位面积的最大所允许残留量,进而可以计算淋洗法和擦拭法检测限度值。
然而,这些计算方法通常不适用于生物制药的原液部分,主要原因是如果污染物残留基于整个生产线的设备共用面积,那么可接受限度可能会非常低,现有分析方法无法检测或者不切实际。可以进行一些设备共用面积区域的限制,比如将共用面积的计算限定为最终的生产罐或者纯化的最终设备,然而相比来讲,更普遍使用的方法是基于传统生物制药生产工艺和清洁工艺的工艺能力制定默认限度值,比如通常可接受限值为上游工艺5-10ppm TOC和下游工艺为1-2ppm TOC[3]。
其他相关可接受限值:
与清洁剂相关的可接受限值,如果使用氢氧化钠和磷酸等常用市售化学试剂作为清洁剂,通常的做法是使用电导率值设定间接可接受限值。如果使用处方清洁剂,可使用上述类似活性成分可接受限值的计算方法。
与微生物负荷水平相关的可接受限值,通常只要达到一般的非无菌生产微生物限度标准(1-2CFU/cm2 表面取样方法)就已经是足够的。对于冲洗取样,一些公司将利用典型 WFI 的值(10 CFU/100毫升) ,而其他公司将利用 100CFU/100 毫升或 1,000 CFU/100 毫升的值。设定较高的限度原因是随后设备将进行灭菌。
与内毒素水平相关的可接受限值,内毒素通常只在最后的冲洗水测定,限度设定通常是注射用水标准 0.25EU/ml。对于用大肠杆菌进行的细菌发酵(革兰氏阴性细菌, 在冲洗过程中能够生产大量的内毒素) , 在发酵和收获步骤后的清洗符合注射用水限度,是不可能完成的,这种情形下,一些公司会设定更高的内毒素水平,例如 5-25 EU/mL。
与设备目视清洁相关的可接受限值,尽管法规中明确规定目视检查不得作为单一的可接受标准使用,但是目视清洁是清洁验证/确认不可缺少的一项操作,如果目视清洁不符合要求,即使残留物的化学检测合格,设备也无法放行。制定目视清洁的可接受限值需要考虑现场的照明情况、观察设备和观察距离等因素,应建立完整的SOP以及对操作人员进行特定的培训。
取样方法
取样方法取决于工艺设备的性质和检测的污染物的性质。常用的取样方法主要包括以下4类[2,3]:
直接取样法,包括目视检查法和仪器法
擦拭取样法
冲洗取样法
空白对照取样法
直接取样法
直接取样法主要是目视检查法,可接受限值可以见上面章节。如果一些设备表面不易观察,可以借助管道内窥镜、光纤视镜和远程可视相机等辅助仪器进行目视检查。
擦拭取样法
擦拭取样涉及使用纤维材料擦拭设备表面(最一般的)。擦拭过程中,表面的残留物被转移至纤维材料上。随后纤维材料被放置在溶剂中,将残留物转移至溶剂中。之后采用可接受的分析技术对溶剂进行残留分析。
冲洗取样法
冲洗取样涉及通过流水冲洗所有相关设备表面移除残留物,残留物将在冲洗水中进行测量。冲洗取样一般分为2种取样方式,一种是在清洁工艺的最终冲洗水中抓取样品,另一种则是使用单独的CIP定量冲洗取样。
两种方法各有利弊,在PDA技术报告29中列出了两种冲洗取样方法的优缺点。
表2:两种冲洗取样方法的优缺点[2]
空白对照取样法
在生物制药生产中,空白对照取样通常是指不包括实际产品,相反的,只包括注射用水或者没有任何产品的水性处理缓冲液的空白运行。在工艺中,注射用水或者缓冲液被认为是清洁确认样品,尤其是对 TOC(或总蛋白),电导率,微生物负荷以及内毒素,作为含有这些残留的生产产品可能存在的污染物的测量。对于原液和制剂/灌装生产进行的空白对照显示了真实的在工艺过程中的污染物残留。
取样回收率研究
法规要求进行取样回收率的研究,以充分确保如果污染物存在于设备表面,能够通过分析方法和取样程序的结合进行监测和定量。通常需要对擦拭取样法和冲洗取样法进行取样回收率研究。
对于擦拭取样和冲洗取样,回收率研究可以作为分析方法验证的一部分进行,或者可以作为单独的研究进行。取样回收率研究是实验室研究,包括不同材质的被取样设备的取样片(如,不锈钢,玻璃,PTFE 和硅胶),加入相应的污染物以进行检测。
对于所有取样的表面都应建立回收率值。比如擦拭取样法通常要求回收率大于50%,最佳回收率范围为70-100%,相对标准偏差应小于15%。
分析方法
清洁工艺的分析方法必须能够充分检测到相关的污染物。分析方法可包括特异性分析方法(比如HPLC、ELISA、PCR等)和非特异性分析方法(比如TOC、总蛋白、电导率、pH等)[2,3]。
两种类型的分析方法各有优缺点。特异性分析方法可以明确分析污染物的大小和结构,反映设备的污染水平,可以适应多种提取溶剂,但是其开发和检测时间比较长,并且只有当污染物明确时才可使用。非特异性分析方法开发和检测时间短,但是无法提供关于污染物具体情况的详细信息,另外,其使用的提取溶剂受限,比如TOC通常需要使用水。
通常优选特异性分析方法。只有当污染物类别较多,或者比如在生物制药的清洁中发生降解和灭活时,非特异性分析方法将更合适。在生物制药中,蛋白类活性成分往往在清洁过程中发生降解和灭活,因此选择TOC作为清洁后污染物残留的合适分析方法。
TOC可以检测蛋白类残留物的有机碳,包括降解的蛋白质、细胞培养或发酵培养基、含有机碳的缓冲液或其他有机材料,比如清洁剂中含有的有机成分。
所有的分析方法均需要进行验证和/或确认。验证和/或确认项目可参考ICH Q2(R2),一般包括准确度、精密度、专属性、检测限、定量限、线性、范围、耐用性和回收率[8]。
清洁工艺验证/确认
清洁工艺验证/确认则是传统的3批次清洁验证运行,在这个过程中根据风险评估确定的取样点进行擦拭取样或冲洗取样,并进行相应检测以及与可接受限值比较,从而证明前面开发和设计的清洁工艺在商业化规模的生产上是有效且稳定的。
除了清洁工艺的验证/确认外,完整的清洁验证还应包括脏滞留时间(DHT)和清洁后保持时间(CHT)的验证[9]。
脏滞留时间(DHT)验证
DHT验证可以包含在清洁工艺的验证方案中,不需要额外单独进行。清洁工艺验证中,规定和记录设别生产结束到清洁开始的时间,即脏滞留时间。日常所允许的DHT时间不应大于验证中放置的时间,比如清洁验证中规定和记录的DHT为24小时,那么在日常清洁过程中,应当在24小时内完成设备的清洁。
清洁后保持时间(CHT)验证
CHT验证可以与产品无关,即对于同一个设备,多个产品可以使用同一个CHT验证的报告。进行CHT验证时,设备已经进行了相应的清洁,并且证明可以达到一定的清洁效果,因此CHT验证主要侧重于检测微生物负荷和内毒素。常规的做法是在清洁过程结束后检测微生物负荷和内毒素,然后放置规定的时间后继续检测微生物负荷和内毒素,也可以在中间放置过程中增加取样点。检测结果均应符合相应标准即可。
清洁工艺验证/确认应具有书面的验证方案和验证报告。其版式可遵循与工艺验证相同的版式。清洁验证/确认方案可考虑包含目的、范围、职责、清洁工艺描述、风险分析结果、取样方法、分析方法、可接受限值、执行注意事项和责任分工、偏差处理、变更控制以及相关文件和附件等。清洁验证/确认报告可考虑包含目的、验证结果总结、偏差处理、变更控制、验证结论和建议、相关文件和附件清单等。
持续清洁工艺确认
持续清洁工艺确认是清洁验证生命周期中的一个关键组成部分,对于清洁验证至关重要,已验证状态的缺失可能会对随后生产的相同或不同产品的质量、安全和纯度带来不良影响。
持续清洁工艺确认的主要工具是变更控制、基于风险的定期监控及数据趋势分析。另外,培训和再培训是人工清洁过程的重要控制方式[3]。
定期监控和趋势分析
定期监控包括对清洁工艺关键参数的监控以及对清洁工艺输出的监控。清洁工艺关键参数,通常包括清洁剂浓度、温度、流量以及清洁各步骤的时间。清洁工艺输出,包括冲洗水pH、电导率、TOC以及微生物负荷内毒素等。
定期监控可以提供分析数据以进行趋势分析,以便在观察到不利趋势时启动调查。定期监控中出现的报警事件以及工艺故障/偏差也应进行趋势分析,以进一步确定根本原因,采取纠正和预防措施。
变更控制
变更控制系统应不仅可以控制清洁工艺的变更,还应能适应设备变更以及生产工艺的变更,比如生产工艺中温度的变更。变更控制系统应能识别影响清洁工艺性能的变更并能够对其进行评估,以确定是否需要重新进行清洁工艺的验证/确认。
变更控制系统还应能评估所有单个变更对清洁工艺的累积影响。当一些微小变更累积进行时,可能会产生显著的影响。变更累积影响的评估可以采用两种方式。一种是定期对所有变更进行文档化的分析(即,变更评估及这些变更对清洁工艺中其他内容的影响)。二是需要借助定期监控程序、报警和趋势分析,以期尽快识别出显著的影响。
总结
清洁验证是监管审评检查的重点项目。如果生产工艺中存在污染和交叉污染的风险,都将是不可接受的严重问题。本篇文章基于现在法规推荐使用的生命周期方法,并结合生物制药生产工艺的特点,讲述了清洁验证生命周期中三个阶段的活动以及在生物制药中的实施注意事项,以期帮助大家完整且系统的理解清洁验证生命周期。随着生物制药产品和工艺的成熟,清洁验证的理念也逐渐完善和进步,这也要求我们能够跟随时代的脚步,在实际的制药产品清洁验证中制定更完善、更科学和更合理的验证策略。
参考文献
[1] FDA Guidance for Industry, Process Validation: General Principles and Practices” 2011.
[2] PDA Technical Report NO 29: Points to Consider for Cleaning Validation. © 2012 Parenteral Drug Association, Inc. ISBN: 978-0-939459-48-3
[3] PDA Technical Report NO 49: Points to Consider for Biotechnology Cleaning Validation. © 2010 Parenteral Drug Association, Inc. ISBN: 978-0-939459-30-8
[4] ISPE Cleaning Validation Lifecycle – Applications, Methods, and Controls. 2020. ISBN 978-1-946964-31-1
[5] Cytiva蓝皮书. 生物制品清洁验证考虑要点:生产工艺清洁方法的开发与验证. www.cytiva.com.
[6] A. Hamid Mollah, Cleaning Validation for Biopharmaceutical Manufacturing at Genentech, Inc. Part 1. BioPharm International-02-01-2008, Volume 21, Issue 2
[7] A. Hamid Mollah, Cleaning Validation for Biopharmaceutical Manufacturing at Genentech, Inc. Part 2. BioPharm International-03-01-2008, Volume 21, Issue 3
[8] ICH Q2(R2) Validation of Analytical Procedures. Final Version Adopted on 1 November 2023
[9] Abhishek Raj, Cleaning Validation in Pharmaceutical Industries. J. Atoms and Molecules/ 4(4); 2014 / 779–783
康日百奥Bioworkshops是一家专业的生物药CDMO,位于苏州工业园区东旺路5号。公司服务范围包括生物药工艺开发、cGMP原液生产、无菌制剂灌装等。团队成员均为经验丰富的生物制药行业资深人士,对生物药CMC领域有着深刻的理解。康日百奥Bioworkshops原液产能13000L,同时拥有包含西林瓶水针,冻干、卡式瓶、预充针、注射笔等的无菌制剂灌装服务,可完全实现从早期临床前样品生产至商业化生产的高效衔接。
康日百奥Bioworkshops已成功帮助多个合作伙伴的单抗、双抗、多抗、ADC、融合蛋白、细胞因子等项目获得中国、美国、澳大利亚等的临床批件。
康日百奥Bioworkshops致力于为全球合作伙伴提供高效、高质量的生物药外包服务解决方案,帮助合作伙伴缩短药物进入临床试验和上市的时间。
公司业务范围:
细胞株构建 | 细胞培养 | 纯化工艺开发 | 制剂处方开发 | 分析方法开发 | 工艺表征工艺验证 | 原液和成品的cGMP生产(200L、500L、2000L) | 无菌灌装(预充针、卡式瓶、注射笔、西林瓶水针、冻干)
联系我们:
energize@bioworkshops.com
www.bioworkshops.com
0512-67999700/18118490181
江苏省苏州市工业园区东旺路5号
康日百奥 商务小助手
24h业务咨询
请添加小助手