文献分享
通过工艺转移和优化，将 GS-CHO细胞系的抗体产量提高至 3 g/L后，观察到抗体 Fc 半乳糖基化出现下降。在 2 L 生物反应器中评估了尿苷 (U)、氯化锰 (M) 和半乳糖 (G) 的特异性增强抗体半乳糖基化的潜力。
该细胞系是在内部开发和选择的，但初始材料是由合同制造商使用其专有工艺生产的。该工艺中的材料具有 18% 的半乳糖基化（表 I），用作对照品、临床前研究和 I 期临床研究。对于继续的临床，该工艺被转移到内部。然而，仅转移了主细胞库，其余的细胞培养工艺进行了重新开发。
内部平台工艺的应用导致初始滴度接近1.5 g/L。抗体糖基化与对照品相似，只是总体半乳糖基化略有降低至 9%。培养基消耗分析表明，半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、天冬氨酸和酪氨酸在运行中接近耗尽，同时特异性抗体生产率下降。
经过几轮氨基酸平衡后，没有氨基酸受到限制，并且每种氨基酸的浓度从开始到结束都大致恒定，细胞特异性生产率在培养过程中得以维持，最终滴度接近 3.3 g/L。然而，半乳糖基化水平进一步下降至 3%。对照品、初始平台工艺和氨基酸优化工艺之间的其他质量属性（SDS-PAGE 和 cIEF 图谱）相似。
氨基酸优化工艺的过程中样品表明，半乳糖含量一开始接近 16%，并随着培养的进行而下降。
文献知识总结显示，对于单克隆抗体的半乳糖基化：
DO 减少导致半乳糖含量减少（Kunkel 等人，1998，2000）；
pH 增加导致半乳糖含量增加（Muthing 等人，2003）；
功率输入比正常值高几个数量级生物反应器的运行导致半乳糖含量降低（GodoySilva 等，2009）；
氨水平升高（Andersen 和 Goochee，1995；Gawlitzek 等人，2000；Gillmeister等人，2009；Hong 等人，2010）已被证明会导致半乳糖基化减少；
渗透压升高（Schmelzer 和 Miller，2002）已被证明会导致半乳糖基化减少；
恒定渗透压下的二氧化碳溶解度升高导致半乳糖基化增加（Schmelzer 和 Miller，2002）；
上述参数在转移到内部工艺中并没有发生变化，细胞培养过程显示这些参数也没有明显变化，并不极端，因此这些非特异选项不是调整半乳糖基化的首先方案，也没有进行进一步的研究。
由于抗体的半乳糖含量在培养过程中下降，因此可能细胞内生物合成减少或细胞外降解增加。半乳糖可能被细胞释放的内源性半乳糖苷酶去除。只有有限的研究探索了通过半乳糖基转移酶向蛋白质添加半乳糖所涉及的因素的影响，包括半乳糖、尿苷和 Mn+。
我们假设，在不影响工艺其他方面的情况下成功操纵抗体寡糖半乳糖含量的最佳机会是将三个因素结合起来，即半乳糖、尿苷和 Mn+。根据文献报道，我们定义1X为尿苷浓度1 mM, MgCl2为0.002 mM，和半乳糖为5 mM。选择将这些成分(UMG)按比例添加到补料培养基中，直到20X的浓度。
结果显示，抗体的半乳糖含量从 0X UMG 时的 3% 增加到 8X UMG 时的 21%，然后增加到 20X UMG 时的 23%。半乳糖基化的总体增加主要是由于 G0F 的下降和 G1F 的相应增加，尽管 G2/G2F 也有上升趋势。 M5 和 A1/A1F 似乎也略有增加(<2%)。在 0X 至 20X UMG 之间，岩藻糖基化保持相对不变，从 97% 略有下降至 94%。未观察到对任何其他质量属性的影响（选择通过 cIEF、SDS-PAGE 和 SEC分析的样品）。
生物反应器中从 0X 到 12X UMG 的运行性能与非常类似，但在添加 16X 或 20X UMG时，虽然细胞生长没有受到影响，导致葡萄糖消耗显著受到抑制。
在开发过程中，对多次 100 L 中试规模运行进行了评估，并添加了最多 2X 的 UMG。由于 2 L 规模的 4X UMG 条件产生的产品质量概况与对照品相似，因此在 1,000 L 规模下进一步评估了该条件。
在所有情况下，较大规模的运行性能与2 L 规模的运行性能相似。此外，更大规模的糖基化谱反映了 2 L 规模的糖基化谱，包括半乳糖基化百分比。有趣的是，在 2 L 规模的较高浓度 UMG 下，G2/G2F和 A1/A1F 的轻微增加在更大规模的运行中持续存在，表明这些增加是可重复的。另外，在 2 L 规模下观察到的 M5% 略有增加的趋势在这些大规模运行中并未持续存在，表明 UMG 添加对 M5% 没有影响。
在最初的开发工作之后，我们分别评估了2 L 规模下高达 12 个浓度的单独成分的影响。
结果显示，单独添加尿苷导致半乳糖基化略有增加，而仅添加半乳糖则观察到进一步增加，并且对于氯化锰获得了混合结果。加成效果是协同的，因为所有三种效果的组合比单独添加每种效果产生更高水平的半乳糖基化。
为了确定影响是否是细胞系特异性的，我们将氨基酸优化的平台流程应用于下一个细胞系，最高可达 2 L 规模的 12X UMG。
正如在第一个细胞系中观察到的那样，添加 UMG 对细胞培养性能的影响极小。第二个细胞系的基本寡糖分布与第一个细胞系观察到的相似（表 I）。使用 0X UMG 时，第二个细胞系的半乳糖基化率为 5%。向第二个细胞系添加 UMG 导致半乳糖基化增加高达 29%，其结构发生与第一个细胞系观察到的类似变化，包括对甘露糖基化、岩藻糖基化和唾液酸化。
这些数据表明，尿苷、氯化锰和半乳糖的组合可用于特异性影响高产补料 GS-CHO 工艺中的抗体半乳糖基化，同时对其他糖型、其他产品质量属性或细胞培养性能的影响很小。这种影响在 2 至 1,000L 规模范围内是可重复的，并且似乎是一种普遍有用的方法，因为在表达不同抗体的第二种 GS-CHO 细胞系中观察到了类似的结果。通过改变这些添加剂的浓度，可以将第一个细胞系中的半乳糖基化水平控制在3％至23％之间，而在第二个细胞系中则可以将半乳糖基化水平控制在5％至29％之间。该方法使得能够设计从3% 半乳糖基化开始的工艺，通过向培养基中添加适量的这些成分来满足 18% 半乳糖基化的可比性目标。
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