一篇来自Amgen的研究文献，主要内容是开发了一种新的、稳健的方法，即以甘露糖为碳源来增加抗体的高甘露糖（HM）水平，同时不会对细胞培养性能产生影响，并探讨了新方法的可能的调节机制。
为了探索不同碳源对细胞生长、抗体产生和HM等质量属性的影响，使用小规模(24深孔板)模拟灌流模型评估了五种不同的糖，包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖和麦芽糖。
结果显示，当半乳糖、果糖和麦芽糖被细胞系1代谢时，细胞生长明显受到抑制。在对抗体Fc聚糖质量属性进行分析后，发现这些培养物中归一化HM水平在165至168之间，比葡萄糖对照组(34.8)高出约5倍。不过，以甘露糖作为碳源培养的细胞系1的生长、活力和标准化抗体滴度与葡萄糖对照相当，但是甘露糖培养物也有很高的标准化HM水平。这表明，与葡萄糖培养相比，培养基中甘露糖的存在影响了抗体Fc聚糖的加工，同时保持了等效的细胞生长和蛋白质产量。
将培养基中的葡萄糖替换为不同量的甘露糖，并进行模拟灌流实验来验证假设的HM调节效果。
结果显示，当培养基中葡萄糖替换为25%、50%、75%和96%的甘露糖时，mAb1的标准化HM水平分别从35.9增加到48.1、63、82.1和100。培养基中甘露糖浓度的改变不影响细胞的生长、活力和归一化抗体滴度。这些结果表明，不同的甘露糖:葡萄糖的比例可以线性调节HM水平，而不影响细胞的生长和生产力
为了检验甘露糖相关的HM调节效应是否普遍适用，与之前的实验一样，在含有不同甘露糖:葡萄糖比例的培养基中培养另外4株产生mAb 2、3、4和5的细胞系。
结果显示，所有四种细胞系在高M:H比下均升高HM。因此，这种调节效应适用于测试的所有细胞系。另外，在所有细胞系中，归一化HM和M:H比值之间存在很强的线性相关。这表明HM可以通过控制培养基中的M:H比来调节。
为了验证HM调制的可放大性，使用mAb1生产工艺进行了1.5 L的生物反应器运行。从第3天开始，向3个生物反应器灌注M:H比分别为0(对照)、0.5和0.94的培养基。在培养期间，每天采集样本，测量细胞计数、细胞活力和代谢物。
这些结果表明，HM调制效应适用于生物反应器工艺和规模。这种效应也是可预测的，r平方值为0.98，这种相关性与规模无关。
为了了解甘露糖调制对抗体Fc聚糖的总体影响，用全聚糖图分析了生物反应器过程中纯化的mAb1。
某些聚糖，包括半乳糖化(G1F + G2F)、M3G0F和唾液化形式，不受培养基中不同的M:H比的影响。高M:H比值显著增加HM，降低G0F。此外，增加的M:H比产生了少量的无岩藻糖和杂化Fc聚糖。一些现有的未确定的聚糖形式也有较小程度的增加。
对各HM种类的百分比进行了鉴定和比较。结果发现，随着培养基中M:H比的增加，Man8、Man7、Man6和Man5聚糖的水平均较对照显著增加。在三种条件下，发现Man5是主要的HM分子。此外，在较高的M:H比下，Man6、Man7和Man8种的增幅高于Man5。这些结果表明，高M:H比减慢了早期的聚糖加工步骤，导致所有HM的水平升高。随着H:M比的增加，在产生的抗体中发现更多的原始HM。
本研究中观察到的HM上调可能涉及GDP甘露糖生物合成、早期糖基化和UDP-GlcNAc生物合成三种途径。原始HM水平的增加表明，甘露糖或其中间体(M6P、甘露糖-1-磷酸[M1P]或甘露糖dp1)浓度的增加可能直接或间接抑制a-MANI活性。高Man5水平也提示可能与UDP-GlcNAc生物合成途径有关。甘露糖或其中间体更有可能影响UDP-GlcNAc的生物合成(通过酶抑制)、运输或GnT1活性。需要了解这些关键酶的转录和表达水平以及它们的酶活性将为确定所涉及的精确抑制机制提供进一步的见解。
在这项研究中，开发了一种新的和强大的方法来增加抗体HM糖型，可应用于多种抗体和细胞系，而不会对细胞培养性能产生不利影响，包括活细胞密度、活力和蛋白质滴度。该方法利用甘露糖作为碳源，补料中甘露糖与总己糖(葡萄糖和甘露糖)的比例决定了细胞培养中表达的抗体中HM聚糖含量的程度。将该策略从3ml小型平板放大到生物反应器(1.5 L)也得到了可比的结果。进一步的全聚糖图分析表明，HM的增加主要与G0F聚糖的减少相关，对其他糖型的影响最小。同时讨论了以甘露糖为碳源调制HM聚糖的可能假设。GDP-甘露糖生物合成、早期蛋白糖基化和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖生物合成三种途径可能参与并促进了这种HM调节。
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