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单克隆抗体表面电荷分布的分析提供了有关单抗翻译后修饰的汇总信息。在文献的工作中，作者建立了一种直接上样的 pH 梯度阳离子交换色谱方法，无需任何纯化步骤即可测定细胞培养上清液的电荷异质性。该工具进一步应用于监控细胞培养工艺条件的执行。
使用弱阳离子交换介质（Dionex ProPac WCX-10 4×250 mm，088768，Thermo Fisher Scientific）。保护柱（4×50 mm）（054994，Thermo Fisher Scientific）。两种复杂的四组分缓冲液来确保高度线性的 pH 梯度。这些化合物是 3-吗啉代-2-羟基丙磺酸（MOPSO，M8389）、4-（2-羟乙基）哌嗪-1-乙磺酸（HEPES，H3375））、N,N-双（2-羟乙基）甘氨酸（Bicine） ，B3879，），3（环己基氨基）-2-羟基-1-丙磺酸（CAPSO，C2278）和3-（环己基氨基）-1-丙磺酸（CAPS，C2632）。
为了确保洗脱仅基于pH 变化，根据表 1 将氯化钠添加到缓冲液 A 中以获得恒定的电导率。用氢氧化钠调节pH。
在本研究中，上清液的流速为 1.0 mL/min，进样体积为 100 µL。两种缓冲系统的洗脱梯度均设置为 0.07 pH/分钟。
评估阳离子色谱分析在不同培养样本上的适用性。将重组产生的抗肿瘤坏死因子-α抗体与阿达利单抗进行比较。
如图1a显示，阿达木单抗在具有线性pH梯度的CEX分析中显示出明显的峰分布，而重组蛋白在pH7的缓冲液系统中具有较好的分离。因此，选择了pH为7的缓冲体系，并将流速设定为1毫升/分钟，用于后续的研究。
为了评估样品是否受到基质蛋白的影响，对上清液样品 (n=36) 和标准品 (n=46) 进行了分析。评估了之前用 BLI 测定的总面积和 IgG 量之间的关系。两者的线性关系表明所建立的性能足以获得标准品和上清液的可靠数据（见图1b）。图1c和d显示了HCP不会与目标蛋白共洗脱。
因此，可以认为HCP和培养物上清液基质对测量的电荷变体分布的贡献被认为不显著。
评估分析方法的一致性，计算了对照标准品 (n= 15) 和第4天收集的分批补料培养（n=8）的酸性、主峰和碱性变体的变异系数 (CV)。
结果显示，对照标准品和分批补料培养收集液的酸峰、主峰和碱峰的变异系数均低于10%。
总结来看，结果表明直接从上清液测定 mAb 电荷分布是可行的。同时还表明该分析方法可靠且可重复。
优化的方法用于监测细胞培养过程中 mAb 电荷异质性，以阐明温度和葡萄糖浓度的影响。
批次工艺每个实验的所有测量变量都表现出相似的趋势。工艺温度对细胞的整体生产率、生长速率和活力有显著影响，降低的工艺温度有利于细胞培养的增殖。尽管培养物中的葡萄糖浓度在 2 至 15 g/L 之间变化，但根据进料和温度的不同，几乎检测不到对工艺的影响。只有渗透压可能与上清液中的葡萄糖浓度部分相关。
为了评估工艺变化对电荷分布的影响，将第 4 天开始的几个分批补料样品，以及温度变化后的样品，应用于 CEX 色谱分析 (n=36)。
工艺参数、葡萄糖浓度和温度的变化在很大程度上影响了电荷变体分布。由于葡萄糖浓度对细胞代谢没有明显影响，因此推测它以细胞外方式影响了 mAb 电荷分布（见图 3a、c、e、g）。产生的碱性物质与这一观察结果相反，因为它们主要源自不完整的 C 末端赖氨酸加工（见图 3b、d、f）。
总体来讲，结果显示，目标蛋白的生产主要受工艺温度的影响，而酸性变体的形成以及产品质量很大程度上受细胞环境中葡萄糖水平的影响。酸性变体的形成可能最终与细胞外机制有关。这些观察结果证实了控制葡萄糖水平对于确保一致的高质量 mAb 输出的重要性。然而，处理温度仍然很重要，因为除了滴度之外，它还影响酸性峰形成以及碱性变体形成的速率。
本篇文献中，作者建立了一种直接上样 pH 梯度阳离子交换色谱分析方法，无需任何纯化步骤即可测定细胞培养上清液的电荷异质性。该工具进一步应用于监控在某些工艺条件下执行的工艺。因而能够深入了解中国仓鼠卵巢细胞培养物分批补料工艺在不同温度和葡萄糖补料策略下生产单克隆抗体时电荷变体的形成。葡萄糖浓度影响酸性变体的总体含量，而碱性变体主要取决于工艺温度。该平台方法将有助于作为复杂的哺乳动物细胞培养工艺的优化工具。它为所生产的单克隆抗体提供了质量指纹，可以对其进行测试，与所需目标进行比较，并在工艺开发的早期进行确认。
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