供稿：郝莹，武汉大学
校稿：郝莹，武汉大学
推送：郝莹，武汉大学
今天给大家分享的文献发表在nature structural & molecular biology上，标题为DNA methylation shapes the Polycomb landscape during the exit from naive pluripotency，通讯作者是来自巴黎西岱大学的Maxim V. C. Greenberg教授。
在哺乳动物中，5-甲基胞嘧啶（5mC）和由Polycomb抑制复合体2（PRC2）沉积的组蛋白H3赖氨酸27三甲基化（H3K27me3）通常在富含CpG的区域互斥存在。当小鼠胚胎干细胞退出原始多能性状态时，伴随着大量5mC的积累，同时H3K27me3被限制在不含5mC的CpG富集区域。为了系统评估5mC如何塑造H3K27me3蛋白结构，作者在DNA是否存在甲基化的两种情况下，对原始和分化细胞的表观基因组进行了分析。结果表明这种5mC独立的H3K27me3限制是由PRC2拮抗剂Ezhip（编码EZH抑制蛋白）的异常表达介导的。作者通过直接调节5mC水平的位点特异性表观基因组编辑，证明了5mC沉积对H3K27me3沉积的拮抗作用，并能够激活单个候选基因。
1 原始多能性状态退出过程中H3K27me3到5mC的动态变化
为了研究5mC和PRC2之间的相互作用，作者在es细胞中进行了全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）和H3K27me3切割。同时为了测试5mC是否在EpiLC（由诱导多能干细胞衍生的表皮样细胞）分化期间驱动H3K27me3丢失，作者在完全缺乏5mC的TKO细胞中进行了平行实验（图1b）。相对于WT EpiLCs，TKO EpiLCs表现出明显升高的H3K27me3分布（图1c）。结果表明，在正常表皮分化期间，5mC限制了H3K27me3在整个基因组中的水平，并且在没有5mC的情况下，H3K27me3可以保持相对广泛的分布。为了量化H3K27me3-to-5mC的动力学，作者对H3K27me3结构域进行了k-均值聚类（图1d，e）。结果中展现了三个主要区域:（1）组成区（CORs），与CGIs大部分重叠并显示H3K27me3富集和低甲基化，；（2）ES细胞特异性区域（ESRs），在WT和TKO EpiLCs中都失去了H3K27me3水平；（3）WT表型中H3K27me3至5mC SWR，其异常维持TKO表型中的H3K27me3水平。即H3K27me3的结构是以独立于5mC（ESR）和依赖于5mC（SWR）的方式形成的。
图1 在缺少5mC的情况下，H3K27me3在大部分基因组中持续存在
2 在TKO EpiLCs中，H3K36me3与H3K27me3失调无关
作者在分化的TKO细胞中观察到H3K27me3水平的全基因组损失（图2a）。鉴于H3K36me2/3和5mC之间的联系，作者测试了在TKO EpiLCs中H3K36甲基化结构是否改变。结果表明，H3K36me3切割和标记分析显示ES细胞和EpiLCs中的H3K36me3和H3K27me3之间存在明显的反相关，并且绝大多数H3K36me3标记的位点在WT EpiLCs中是DNA甲基化的。WT对TKO的差异分析显示了高度相关的H3K36me3模式。相对于WT EpiLCs，TKO EpiLCs中显示H3K27me3水平增加的区域没有显示H3K36me3的伴随缺失。图2 5mC通过Ezhip沉默间接调节H3K27me3的传播
3 Ezhip表达减轻H3K27me3在全膝关节表面癌中的扩散
Ezhip在ES细胞中强烈富集H3K27me3（图2b）。在WT EpiLCs中，Ezhip启动子表现出丰富的5mC，并被转录抑制（图2b，c）。然而，与以前的报道一致，未甲基化的Ezhip在TKO上皮细胞中高度转录（与WT相比上调> 300倍）（图2c）。为了确定Ezhip的表达是否限制缺乏5mC的EpiLC中的H3K27me3，作者使用成簇的规则间隔短回文重复序列（CRISPR）-Cas9在TKO ES细胞中基因去除Ezhip并进行EpiLC分化。与TKO EpiLCs相比，QKO EpiLCs显示H3K27me3水平的整体增加（图2d）。通过QKO与TKO EpiLCs中的CUT&Tag进行的H3K27me3分布的全基因组分析揭示了缺乏Ezhip的细胞中H3K27me3的富集程度增加（图2e）。H3K27me3在WT表淋巴细胞中最受限制，在QKO表淋巴细胞中分布最广（图2f，g）。结果表明，在缺乏5mC的情况下，分化细胞仍然可以通过Ezhip表达来限制H3K27me3。
接下来，作者探究了SWRs是否跨越了H3K27me3发挥基因调节作用的区域，以及经过延伸后DNA甲基化沉积是否影响PRC2介导的基因控制。虽然2426个基因在TKO上皮细胞中上调，但在TKO上皮细胞中有1048个基因显著下调（图3a），基因在TKO表型中显著下调（图3b）。SWRs与TKO表型细胞中163个下调基因的启动子重叠， 87个在Dnmt1 KO外胚细胞中下调（图3a-c）。此外，112个候选SWR基因在含有PRC1亚基Pcgf3、Pcgf5和PCG F6 TKO的ES细胞中上调，表明两种Polycomb复合物协同抑制低甲基化细胞中SWR基因的表达（图3c）。对5mC、H3K27me3和表达水平的综合分析显示，与Zdbf2CGI启动子重叠的H3K27me3上游通常在野生型EpiLCs中受到限制，与5mC沉积和基因激活相关（图3d）。相反，TKO EpiLCs表现出异常维持的H3K27me3，其延伸到CGI启动子并与维持的转录抑制相关联（图3d）。在包括Apt4a、Celsr2、Pdyn、Krt80、Pga5和Arsi在内的其他162个候选基因上观察到类似的5mC介导的H3K27me3限制和基因激活模式（图3a–d）。这些数据表明，随着细胞从初始状态分化，5mC可能通过多梳拮抗作用对基因表达具有激活作用。
图3 5mC可能促进分化过程中基因亚群的激活
5 5mC在Zdbf2的沉积与H3K27me3拮抗
为了直接评估5mC沉积对H3K27me3限制性和附近基因表达的影响，作者建立并使用了互补的定点表观基因组编辑方法。首先，作者产生了一种诱导型细胞系，在低甲基化的ES细胞中选择性地将5mC靶向SWRs（图4a）。作者在Zdbf2 SWR区域（22-29%）获得了稳定且高度可重复的5mC沉积（图4b）。作者接下来使用qPCR来评估对H3K27me3富集的影响（图4c）。结果表明，尽管丢失了H3K27me3，但在表观基因组编辑的细胞中Zdbf2表达水平没有显著改变（图4d）。这可能是因为H3K27me3的不完全耗尽，这也可能是因为与已知调节Zdbf2的EpiLC特异性增强子的持续分离。
图4 原始ES细胞中的5mC沉积拮抗Zdbf2 SWR的H3K27me3
6 10-11易位甲基胞嘧啶双加氧酶1（TET1）编辑能够维持和沉默H3K27me3
第二种方法作者的目标是在EpiLCs中进行位点特异性5mC编辑。作者使用piggyBac转座整合了dCas9–SunTag/TET1CD构建体（图5a），并以这种方式在大多数细胞中观察到构建体的强表达，然后通过荧光激活细胞分选（FACS）富集GFP阳性细胞。结果表明，EpiLCs中所有目标的5mC水平的显著和非常显著的降低（图5b）。对于Zdbf2、Atp4a和Celsr2，作者在表观基因组编辑的细胞中观察到H3K27me3相对于靶SWR的显著富集（图5c）。Zdbf2、Atp4a和Celsr2在主动去除5mC时显示H3K27me3水平的明显维持，在表观基因组编辑的细胞中下调（图5d）。结果表明，除了在原理验证位点Zdbf2验证作者的表观基因组编辑方法外，作者还能够鉴定Atp4a和Celsr2是以DNA甲基化依赖方式激活的基因。通过使用靶向方法也能区分真正的SWR和在TKO EpiLCs中表现出SWR样行为的位点。作者的TET编辑方法证明了通常与基因沉默相关的两条染色质通路之间的拮抗作用，这在某些情况下可以导致基因调节输出的变化。它还强调了表观基因组编辑的力量，以从组成型KOs中经常出现的混杂效应中辨别基因特异性染色质调节。
图5 在分化的ES细胞中SWRs的靶向去甲基化导致H3K27me3不能激活Zdbf2、Atp4a和Celsr2
总之，本文探究了5mC与H3K27me3在模拟早期胚胎动力学的系统中的拮抗作用。结果表明，H3K27me3的约束直接或间接依赖于5mC，同时揭示了5mC在基因激活中的非典型作用。这不仅对正常发育很重要，也可能对癌症进展有重要意义。
文章编号：475
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41594-024-01405-4
原文引用：
Julien Richard Albert, Teresa Urli, Ana Monteagudo-Sánchez, Anna Le Breton, Amina Sultanova, Angélique David, Margherita Scarpa, Mathieu Schulz Maxim V. C. Greenberg*. DNA methylation shapes the Polycomb landscape during the exit from naive pluripotency. Nat Struct Mol Biol， 2024， DOI:10.1038/s41594-024-01405-4.
