供稿：赵晨茜，武汉大学
校稿：刘玮，武汉大学
推送：刘玮，武汉大学
今天给大家分享的文献发表Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America上，标题为Zfp106 binds to G-quadruplex RNAs and inhibits RAN translation and formation of RNA foci caused by G4C2 repeats，通讯作者是加州大学旧金山分校医学院Brian L. Black教授。
锌指蛋白106（Zfp106）主要定位于核仁和剪接体附近的核斑点，是RNA结合蛋白，参与RNA代谢的多个方面，包括前rRNA加工、剪切和polyA mRNA结合。Zfp106在运动神经元特异性表达的恢复显著抑制了基因敲除小鼠的表型，这表明Zfp106对神经肌肉功能和运动神经元活力的需求是独立于运动神经元的。
家族性肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）是一种相关的脑神经退行性疾病，最常见的原因是C9orf72基因的第一个内含子中六核苷酸序列GGGGCC异常扩增。健康个体的六核苷酸重复序列通常少于30个拷贝，而受影响的患者的C9orf72基因中可能有数百到数千个重复序列。目前已提出GGGGCC重复序列的扩增通过两种不同的功能获得机制引起神经变性。
为了深入了解Zfp106如何抑制由GGGGCC重复序列表达诱导的细胞病变，作者将 Zfp106表达质粒与pCMV-（GGGGCC）30-EGFP质粒或仅具有3个GGGGCC重复序列的对照 pCMV质粒拷贝到Neuro-2A 细胞中，并在有无Zfp106表达的情况下检测eGFP RNA和蛋白质表达情况（图1）。结果显示，Zfp106 显著抑制含有30个拷贝GGGGCC重复序列的eGFP mRNA的蛋白表达，而不影响mRNA的表达水平（图1）。Zfp106 不影响eGFP cDNA的5′ UTR中含有6×或60×亨廷顿病相关CAG重复序列的质粒的eGFP蛋白表达（图 1）。这些数据表明，Zfp106特异性抑制了包含30×GGGGCC 重复序列的eGFP mRNA的翻译。
图1 Zfp106抑制GGGGCC诱导的RAN翻译
接着，作者研究了 Zfp106对含 GGGGCC 重复序列的 RNA foci的影响（图2）。作者将29×GGGGCC或47×CAG重复序列标记有12×MS2发夹（可以通过共表达YFP标记的MS2外壳结合蛋白来可视化）质粒转染进细胞（图2）。结果表明，在该系统中29×GGGGCC RNA重复序列诱导大量RNA foci形成（图2）。与RFP对照组相比，Zfp106共表达显著减少了GGGGCC RNA重复序列诱导的RNA foci形成（图2）。而Zfp106对47×CAG重复序列诱导的RNA foci的形成没有影响（图2）。作者还通过使用针对MS2发夹环的 RNA FISH 探针检查了每个细胞核的foci数量，发现Zfp106基本上消除了foci的形成。
图2 Zfp106抑制GGGGCC重复序列诱导的RNA foci的形成
然后，作者使用电泳迁移率实验（EMSA）来检测全长Zfp106（图3）与多种RNA重复序列的结合能力，包括预测形成G-四链体的序列和发夹或其他非G-四链体二级结构的序列（图3）。Zfp106与形成G-四链体的所有序列结合，而它未能与所有非G-四链体形成序列显著结合（图3）。在促进G-四链体形成的条件下，Zfp106与GGGGCC重复序列有效结合，而Zfp106与GC茎环（GC-SL）序列（图3）或CAG重复序列（图3）几乎没有结合。
图3 Zfp106与形成G-四链体的RNA序列结合
最后，作者通过圆二色谱（CD）分析了Zfp106（Zfp106[WD40+ZnF]）的C端43 kD片段与GGGGCC重复序列的相互作用。CD实验表明，（GGGGCC）4 RNA分子形成平行G-四链体结构，在236 nm处形成负峰，在264 nm处形成正峰（图4）。（Zfp106[WD40+ZnF]）的CD 光谱在210至220 nm范围内显示负峰，但在264 nm处基本没有信号（图4）。以RNA（GGGGCC）4等摩尔比浓度添加Zfp106的C端43 kD片段，结果显示，在264 nm处峰的降低和变宽，以及250至300 nm范围内CD光谱形状的偏移（图4）。表明，（Zfp106[WD40+ZnF]）会导致（GGGGCC）4的G-四链体结构发生构象变化。
图4 Zfp106改变GGGGCC重复序列的G-四链体结构
综上所述，作者发现含有锌指的RNA结合蛋白Zfp106能够抑制RNA foci的形成，显著降低由GGGGCC重复序列引起的RAN翻译。且Zfp106会与RNA G-四链体结合，并导致GGGGCC重复序列形成的G-四链体发生构象变化。
文章编号：484
原文链接：
https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.原文引用：
Barbara Celonaa, Sally E. Salomonsson, Haifan Wua, Bobo Danga, Huong T. Kratochvila, Claire D. Clelland, William F. DeGrado, and Brian L. Black*. Zfp106 binds to G-quadruplex RNAs and inhibits RAN translation and formation of RNA foci caused by G4C2 repeats. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2024,121 (31) e2220020121.
