供稿：岗方印，武汉大学
校稿：郝莹，武汉大学
推送：郝莹，武汉大学
今天给大家分享课题组2024年发表在Analytical Chemistry上的文章，标题为Bisulfite-Free and Quantitative Detection of DNA Methylation at Single-Base Resolution by eROS1-seq，岗方印和谢能彬是论文的共同第一作者。
5-甲基胞嘧啶（5mC）是哺乳动物中最重要的表观遗传修饰，在基因表达调控、细胞分裂与分化和染色质重塑等多种生物学过程中发挥重要作用。在哺乳动物细胞中，5mC的去甲基化过程是通过Ten-Eleven易位蛋白（TET）连续氧化生成5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）、5-甲酰胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC）。5fC和5caC进一步通过碱基切除修复转化为未修饰的胞嘧啶（C）。与之不同的是，植物首先通过具有糖苷酶/裂解酶活性的沉默抑制因子1（ROS1）切除5mC的糖苷键，形成无碱基位点（AP），再通过β和δ消除将AP位点裂解，最后经核酸修复系统完成DNA去甲基化。为了揭示基因组中5mC的功能，需要对基因组内的5mC进行精确的定位及定量分析。亚硫酸氢盐测序（BS-Seq）作为5mC测序分析的金标准，已被广泛应用于5mC的定位及定量分析中。然而，该方法具有一定的局限性。首先，其反应条件苛刻，会造成DNA降解；其次，序列中不含修饰的C转化为胸腺嘧啶（T），会降低序列的复杂性，造成DNA碱基不平衡。近年来，已经开发了多种不含亚硫酸氢盐的5mC测序方法，如EM-seq和EAC-seq等。虽然EM-seq和EAC-seq的反应条件温和，但是仍然需要将不含修饰的C转化为T，面临DNA碱基不平衡和假阳性过高的风险。在本研究中，我们通过对野生型ROS1（wtROS1）蛋白进行人工改造，获得了具有更高活性的工程ROS1（eROS1）蛋白。eROS1可以有效切除双链DNA中的5mC，但是对DNA中的C或β-葡萄糖基-5-羟甲基胞嘧啶（5gmC）没有活性。基于eROS1特性，我们建立了一种eROS1辅助的测序方法eROS1-seq，用于在单碱基分辨率下对DNA中的5mC进行定位及定量分析（图1）。在eROS1-seq中，eROS1蛋白首先将DNA中的5mC切除并产生一个3’端为-PUA，5’端为-PO4的单核苷酸缺口。随后，在核酸内切酶Ⅳ（Endo Ⅳ）的作用下将3’端-PUA转化为3’端-OH（图1A）。最后，在DNA聚合酶和连接酶的作用下在缺口处填上一个dTTP，实现5mC到T的转化。C和糖苷酶保护后的5hmC（5gmC）不被eROS1切除，在测序过程中读为C，而5mC经eROS1处理后在测序过程中读为T（图1B）。与BS-Seq相比，eROS1-seq仅将5mC转化为T而不改变普通的C（图1C），是一种直接的5mC定位及定量方法，具有反应条件温和、不造成DNA降解，不产生碱基不平衡且假阳性率低的优势。
图1 eROS1-seq用于DNA中5mC定位分析的原理
由于wtROS1不能有效切割DNA中的5mC，我们对wtROS1进行了工程改造，并发现携带F947I和N948R双突变的eROS1蛋白具有更强的5mC糖苷酶活性（图2A和2B）。随后，我们优化了eROS1切割5mC的反应条件，并发现100 pmol的eROS1蛋白可以在2小时内将3 pmol的5mC完全切除（图2D和2E）。上述结果说明eROS1能有效切除5mC。
接下来，我们进一步确定了eROS1-seq中C、5mC、5hmC和5gmC的测序结果（图3A）。合成的C-DNA、5mC-DNA、5hmC-DNA和5gmC-DNA经eROS1和Endo Ⅳ处理后，DNA上的5mC在测序过程中被读作T；DNA上的5hmC在测序过程中部分读作C，部分读作T；而DNA上的C和5gmC在测序过程中均被读作C（图3B和图3D）。
图3 eROS1对C、5mC、5hmC和5gmC的活性
为了确定eROS1-seq定量检测5mC的准确性，我们将合成的DNA-C和DNA-5mC进行混合，使位点中的5mC含量在0%-100%之间，随后利用eROS1-seq对混合后DNA序列中的5mC进行定量分析。通过比对eROS1-seq的测定结果和上述DNA链的原始混合比，即可判断eROS1-seq检测5mC的准确性。结果表明，随着DNA序列中5mC含量的增加，eROS1-seq测序结果中T的占比亦逐渐增加（图4A），且测序结果中T的占比与原始序列中5mC的含量相近，并呈现良好的线性关系（图4B）。该结果表明，eROS1-seq可以对特定位点中不同化学计量比的5mC进行准确的定量分析。图4 特定位点中不同化学计量比5mC的定量分析
DNA异常甲基化与肿瘤的发生、发展有着密切的联系，特定基因的甲基化程度可以作为肿瘤诊断的指标。据报道，在肺癌中，癌基因EGFR的基因内部特定位点内存在5mC含量下降的现象。EGFR异常甲基化会激活促进肿瘤生长、侵袭和转移的下游信号通路。在此研究中，我们通过eROS1-seq对人类肺部正常组织及相应肺癌组织中癌基因EGFR内部特定位点的5mC含量进行检测，并将检测结果与BS-seq测得的5mC含量进行了对比。结果表明，eROS1-seq测得的EGFR基因内部特定位点内确实存在5mC含量下降的现象（图5A和图5B），且eROS1-seq在这些位点测得的5mC含量与BS-seq测得的5mC含量相近（图5A和图5B）。该结果证实了eROS1-seq能够在单碱基分辨率下定量检测5mC。
图5 利用eROS1-seq定量检测EGFR基因体中的5mC
综上所述，我们建立了一种eROS1-seq方法，用于单碱基分辨率下无需亚硫酸氢盐的DNA中5mC定位及定量检测。利用该方法，成功实现了肺癌组织和邻近正常组织基因组DNA中特定位点5mC水平的定量分析。与BS-seq相比（图6），eROS1-seq仅将5mC转化为T而不改变普通的C，保留了序列的复杂性不造成碱基不平衡。此外，反应条件温和、不造成DNA降解。总之，所开发的eROS1-seq是一种直接、单碱基分辨率和无需亚硫酸氢盐的5mC定量方法，对揭示DNA中5mC的功能具有重要价值。
文章编号：477
原文链接：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.4c05030原文引用：
Fang-Yin Gang#, Neng-Bin Xie#, Min Wang, Shan Zhang, Tong-Tong Ji, Wei Liu, Xia Guo, Shu-Yi Gu, Bi-Feng Yuan*. Bisulfite-Free and Quantitative Detection of DNA Methylation at Single-Base Resolution by eROS1-seq. Anal. Chem., 2024. DOI: 10.1021/acs.analchem.4c05030（#为共同第一作者）
