供稿：邵文铉，武汉大学
校稿：郝莹，武汉大学
推送：郝莹，武汉大学
大家好，今天给大家分享的文献是课题组发表在Chinese Chemical Letters上的文章，标题为Quantitative analysis of N6-methyladenine at single-base resolution in mitochondrial DNA of hepatocellular carcinoma by deaminase-mediated sequencing。邵文铉和吴建元是论文的共同第一作者。
N6-甲基腺嘌呤（6mA）是一种普遍的DNA修饰，与多种人类疾病有关。以往的研究表明，哺乳动物线粒体DNA（mtDNA）富含6mA，其功能是调节线粒体转录、复制和活性。然而，目前尚不清楚癌组织和正常组织之间mtDNA中6mA位点的水平是否存在差异。在这项研究中，我们利用课题组最近开发的脱氨酶介导的测序方法（DM-seq）来探索mtDNA 6mA在肝细胞癌（HCC）中的改变和生理意义。
图1 DM-seq方法的原理
在DM-seq方法中，TadA8e蛋白有效地使DNA中的腺苷（A）脱氨基以生成肌苷（I），但它不会使6mA脱氨（图1a）。I与胞嘧啶（C）配对，而6mA与胸腺嘧啶（T）配对。在随后的测序过程中，I被读作鸟嘌呤（G），而6mA被读作A（图1a）。Sanger测序结果表明，DM-seq方法可以在单碱基分辨率下准确识别和定位DNA中的6mA（图1b）。接下来，我们使用DM-seq分析HCC组织和对应的癌旁组织mtDNA中的6mA。对来自两对HCC组织的4个mtDNA样本进行DM-seq分析，测序文库的制备过程如图1c所示。我们将高通量测序原始数据中的核DNA片段过滤，以确保读取的片段完全映射到mtDNA。随后，从这4个样本中获得185528、196256、166711和178580个读数，平均测序深度为134。我们的重点是先前鉴定的HepG2细胞mtDNA中存在的16个6mA位点。Circus图显示了本研究在HCC组织及其相应的正常组织mtDNA中鉴定出的16个6mA位点（图2）。图2 利用DM-seq在HCC组织及其相应的正常组织mtDNA中鉴定6mA位点
随后，我们使用Sanger测序来验证高通量测序鉴定的6mA位点。使用Sanger测序对未处理和TadA8e处理后PCR产物进行比较，结果显示除了6241和6293两个位点在脱氨后仍读作A外，在脱氨前最初鉴定为A的所有其他位点在TadA8e处理后均转化为G（图3）。这一发现证实了通过高通量测序鉴定的6241和6293两个位点6mA修饰的真实性。
图3 通过Sanger测序验证mtDNA中的6mA位点
接下来，我们进行统计分析以评估HCC和癌旁组织之间6mA水平的变化。分析显示，与相应的癌旁组织相比，两个HCC组织中的6mA水平总体上调（图4）。图4 通过DM-seq获得的HCC组织和癌旁组织mtDNA中16个位点6mA水平的统计分析
在mtDNA中鉴定的16个6mA位点中，1个6mA位点位于D-loop区域内，而其余15个6mA位点位于基因的外显子区域内。具体来说，在NADH脱氢酶2（ND2）和NADH脱氢酶4（ND4）基因区域均观察到三个6mA位点，在NADH脱氢酶1（ND1）和NADH脱氢酶5（ND5）基因区域检测到两个6mA位点（图5）。值得注意的是，这四个基因编码NADH脱氢酶的基本亚基。此外，在细胞色素c氧化酶I（COX1）区域内鉴定出三个6mA位点，在细胞色素c氧化酶II（COX2）区内鉴定出两个6mA位点，它们编码细胞色素c氧化酶的不同亚基。这两种酶在细胞呼吸过程中都起着至关重要的作用。
图5 mtDNA中不同基因中鉴定出的6mA位点的数量
接下来，我们继续评估6mA水平变化对mRNA表达的影响。以2号样本为例，与癌旁组织相比，HCC组织不同基因区域的6mA水平呈上升趋势（图6a），而由6个基因编码的mRNA水平下调（图6b）。结果表明，虽然6mA水平上调，但这些基因的mRNA水平同时下调，表明6mA水平升高抑制了与这些基因相关的转录过程。这些发现与之前的一项研究一致，该研究显示AlkB同源物1组蛋白H2A双加氧酶（ALKBH1）表达降低，导致与mtDNA相关的6mA水平增加，随后导致mtDNA编码的NADH脱氢酶亚基表达降低。
总之，利用DM-seq，我们研究了HCC组织和癌旁组织的mtDNA中16个6mA位点水平的变化。研究结果显示，与HCC发展相关的mtDNA 6mA总体水平升高。此外，我们发现6mA含量的上调伴随着它们各自的mRNA水平的下调，这表明6mA含量升高抑制了这些DNA片段相关的转录过程。本研究阐明了6mA修饰与转录调控之间的复杂关系，为HCC发病机制提供了有价值的见解。
文章编号：479
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1001841724012634?via%3Dihub原文引用：
Wen-Xuan Shao#, Jianyuan Wu#, Gaojie Li, Yi-Hao Min, Qiu-Shuang Hu, Yu Liu, Weimin Ci, Bi-Feng Yuan*. Quantitative analysis of N6-methyladenine at single-base resolution in mitochondrial DNA of hepatocellular carcinoma by deaminase-mediated sequencing. Chin. Chem. Lett., 2024. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cclet.2024.110747.（#为共同第一作者）
