供稿：王敏，武汉大学
校稿：郝莹，武汉大学
推送：郝莹，武汉大学
今天给大家介绍课题组2024年12月发表在Science China Life Sciences上的文章，题目是Bisulfite-Free Whole-Genome Mapping of 5-Methylcytosine at Single-Base Resolution by NTD-seq。王敏和谢能彬为论文第一作者和共同第一作者。
DNA甲基化和组蛋白修饰通过改变DNA和染色质的空间结构是表观遗传调控系统的关键驱动因素。DNA胞嘧啶甲基化(5-methylcytosine, 5mC)是哺乳动物DNA甲基转移酶（DNMT）通过在胞嘧啶的C-5位置添加甲基而形成的一种重要的表观遗传修饰。5mC被称为DNA上的“第5碱基”。作为DNA上的动态修饰分子，5mC在调控基因表达、胚胎发生和肿瘤发生等方面起着重要的生理作用，DNA甲基化异常与多种疾病密切相关。因此，建立全基因组范围内DNA甲基化的定位分析对于理解其动态变化和生物学意义至关重要。到目前为止，科研人员已经提出了一些对DNA中的5mC进行定位分析的方法。甲基化DNA免疫沉淀测序法（MeDIP-seq）和甲基化CpG结合域测序法（MBD-seq）。然而，这些方法不能在单碱基分辨率下精确地实现5mC的单碱基分辨率定位。亚硫酸氢盐测序已被广泛用于5mC定位分析。但是，亚硫酸氢盐苛刻的反应环境会造成99.9%以上的DNA降解。TET辅助的吡啶硼烷测序（TAPS），酶促脱氨法测序（EM-seq）和甲基转移酶标记与A3A脱氨测序（DM-seq）等方法不断被开发，用于DNA中5mC的检测。但是这些方法涉及多个反应步骤，操作复杂且经济和时间成本较高。为了克服这种局限性，诸如单分子实时（SMRT）和纳米孔测序等替代技术已经成为检测DNA修饰的有前途的方法，但是这两种方法均存在较高的假阳性率。研究表明，与哺乳动物来源双加氧酶相比，尾刺耐格里原虫（Naegleria gruberi.）来源的双加氧酶TET1（Naegleria TET-like proteins, nTET）在更广泛的序列背景下对5mC表现出强大的催化活性。此外，野生型胞嘧啶脱氨酶（wtA3A）对C和5mC具有优异的脱氨基活性，但对5hmC的脱氨基活性较弱。基于此，我们课题组进化出一系列具有独特脱氨基活性的人工改造的胞嘧啶脱氨酶，分别建立了对特定位点上和全基因组范围内5hmC的定位分析测序方法EDM-seq和SSD-seq。基于先前的工作，我们通过对wtA3A蛋白进行进一步的人工改造，获得了对C和5mC完全脱氨基，而对5hmC没有脱氨基能力的胞嘧啶脱氨酶突变体A3Am。在本工作中，我们提出了一种新型的nTET蛋白辅助A3Am的测序方法（NTD-seq），用于全基因范围内DNA甲基化的定位和定量分析（图1）。在NTD-seq方法中，C被A3Am脱氨基形成U，与A配对，在测序中被读作T。相反，5mC被nTET转化为氧化产物5moC（包括5hmC、5fC和5caC），抵抗A3Am的脱氨作用，在测序中仍被读取为C（图1A）。NTD-seq中C和5mC的测序读序差异实现了DNA中5mC的单碱基分辨率定位分析（图1B）。
图1 NTD-seq用于DNA中5mC定位分析的原理
首先，我们合成了59-mer的5mC-DNA和150-bp的5mC-DNA核苷酸链并采用LC-ESI-MS/MS技术筛选了三种不同物种来源的双加氧酶AlkB、CcTET、nTET。采用不同的双加氧酶分别对59-mer的5mC-DNA和150-bp的5mC-DNA进行氧化及酶解处理，并利用LC-ESI-MS/MS考察对5mC的氧化性质。结果表明，nTET双加氧酶对ssDNA及dsDNA氧化活性分别为99%和97%，均高于AlkB对ssDNA、dsDNA氧化活性（87%、75%）以及CcTET对ssDNA、dsDNA氧化活性（73%、53%）（图2A）。59-mer的5mC-DNA定量结果表明，经过nTET双加氧酶处理后，生成了17%的5hmC，73%的5fC和7%的5caC（图2B）。同时通过提取的离子色谱图可以看出，nTET反应前体系中只有5mC的色谱峰，当加入nTET后，明显检测到新生成的5hmC、5fC及5caC（图2C）。以上结果表明，5mC可以有效的被nTET双加氧酶氧化成5moC，且产物以5fC为主。图2 LC-ESI-MS/MS法测定不同双加氧酶的氧化活性
根据wtA3A蛋白的晶体结构，该蛋白的loop1和loop7区域的氨基酸在底物的识别和固定上起到至关重要的作用，特别是loop1区域31位苏氨酸（T31）和loop7区域130位酪氨酸（Y130）可以与胞嘧啶的嘧啶环产生类氢键的作用力，可以直接影响底物在催化中心的固定。基于此，我们对wtA3A蛋白loop1和loop7区域的氨基酸进行改造。此外，有相关文献报道，APOBEC3G蛋白loop1结构中的EPWVR氨基酸组成对于底物识别和结合具有至关重要的作用。因此，我们获得了特定氨基酸组成的A3Am蛋白（图3A）。随后，利用Sanger测序技术对A3Am蛋白的脱氨基特性进行确定。经A3Am蛋白的处理，DNA上处于不同序列的C均被脱氨基并在测序过程中读作T；DNA上处于不同序列的5mC均被氧化为5moC，不被A3Am脱氨基并在测序过程中读作C（图3B）。与wtA3A不同，A3Am在不同序列背景下对C和5mC表现出较强的脱氨基效率；但对5hmC无脱氨活性（图3C）。由于这种选择性活性，A3Am可以作为区分5hmC和C/5mC的工具。此外，我们利用质谱分析定量评估了wtA3A和A3Am在不同序列背景下对C、5mC和5hmC的脱氨效率（图3D）。A3Am处理后5mC/5hmC-dsDNA、5fC-dsDNA和5caC-dsDNA的Sanger测序结果再次表明，A3Am对5mC具有优异的脱氨基活性，而对5hmC，5fC，5caC完全没有脱氨基活性（图3E-G）。
图3 A3Am对胞嘧啶修饰脱氨作用的表征
基于nTET和A3Am蛋白的特性，我们建立了可以对DNA中全基因组范围内5mC定量分析的方法NTD-seq，并采用Sanger测序和单克隆技术对该方法的原理进行了验证（图4A-C）。为了确定NTD-seq定量检测DNA中5mC的准确性，我们将合成的C/C-dsDNA和C/5mC-dsDNA进行混合使5mC的含量在0~100%之间，并利用NTD-seq对不同序列中的5mC含量进行测定，通过对比NTD-seq的测定结果和上述DNA链的原始混合比，即可判断NTD-seq检测5mC的准确性。结果显示，计算出的不同序列中C和5mC的含量与DNA混合物中不同序列中C和5mC的含量相近，并呈现良好的线性关系（图4D-E）。图4 NTD-seq方法的建立
全基因组5mC的测序分析对揭示5mC的生物学功能至关重要。在研究中，我们分别利用NTD-seq和BS-seq对HEK293T全基因组中5mC进行了测序分析。结果显示，两种方法测得的5mC具有较高的匹配率83.2%和较低的数据重复率3.1%（图5B）。两种方法测得的在不同染色体及特定基因上的5mC含量具有较高的一致性，同时，两种方法测得的5mC均主要存在于CpG位点中（图5C-G），此外，NTD-seq和BS-seq方法测定的不同基因调控元件和基因体及2 kb侧区的5mC分布基本类似（图5H-I）。上述结果均证实NTD-seq可以在全基因组范围内定位和定量检测5mC。
图5 NTD-seq和BS-seq对全基因组范围内5mC的定位和定量分析
NTD-seq提供了一种直接、准确和全面的方法来测序全基因组范围内DNA甲基化修饰，而不会造成亚硫酸盐测序中报道的DNA损伤。尽管NTD-seq不能区分5mC和5hmC，但大多数哺乳动物基因组中5hmC的丰度低于5mC，这有助于缓解该方法存在的限制。然而，当需要区分5mC和5hmC时，将NTD-seq与我们之前建立的SSD-seq方法相结合，可以在单碱基分辨率下定量检测基因组DNA中的5mC和5hmC（图6）。通过比较SSD-seq数据和NTD-seq结果，可以区分5mC和5hmC，并在单碱基分辨率下准确检测两者。展望未来，预计NTD-seq以及SSD-seq测序方法将成为研究表观遗传修饰的学术研究和临床诊断的宝贵工具。
图6 NTD-seq和SSD-seq对5mC和5hmC定量分析原理示意图
文章编号：476
原文链接：
https://www.sciengine.com/SCLS/doi/10.1007/s11427-024-2702-8原文引用：
Min Wang#, Neng-Bin Xie#, Fang-Yin Gang, Shan Zhang, Li Zeng, Jun Xiong, Xia Guo, Ying Hao, Yu Liu, Bi-Feng Yuan*. Bisulfite-Free Whole-Genome Mapping of 5-Methylcytosine at Single-Base Resolution by NTD-seq. Sci China Life Sci, 2024. DOI:10.1007/s11427-024 -2702-8.（#为共同第一作者）
