供稿：张杉，武汉大学
校稿：郝莹，武汉大学
推送：郝莹，武汉大学
今天给大家分享的文献发表在Nucleic acids research上，标题为Spatial regulation of NSUN2-mediated tRNA m5C installation in cognitive function，通讯作者是美国宾夕法尼亚大学的Yuanquan Song和Kathy Fange Liu教授。
RNA上的动态修饰是基因表达过程中一种重要的调控机制。其中，化学修饰会影响RNA结构、RNA稳定性、碱基配对、与蛋白质伴侣的结合和整体RNA功能。RNA和RNA修饰酶与各种生物过程有关，它们的失调与许多人类疾病有关。tRNA的酶介导修饰，如核定位的NOP2/Sun RNA甲基转移酶2（NSUN2）介导的5-甲基胞嘧啶（m5C）修饰，在神经元发育和功能中起着至关重要的作用。然而，对这些修饰的生成和生物功能的探究和理解并不完善。在这项研究中，作者证明了与智力残疾相关的核质定位的G679R NSUN2突变体减少了人类细胞系和果蝇中NSUN2介导的tRNA m5C，并通过一系列细胞和生化检测揭示了G679RNSUN2功能障碍的分子机制。 人源NSUN2在可变环中的大多数细胞质tRNA上修饰m5C（图1A）。其中G679R是唯一被报道过的已鉴定的导致智力残疾的NSUN2突变，且尚不清楚细胞质G679R-NSUN2是否可以在tRNA中修饰m5C。作者首先构建了NSUN2敲除的HEK293T细胞。LC-MS/MS分析结果表明，NSUN2 KO后，两个单菌落中小RNA（<200 nt）的m5C水平显著降低。接下来，作者在NSUN2 KO细胞中表达了野生型（WT）-NSUN2和G679R-NSUN2。免疫荧光成像结果表明，WT-NSUN2在核仁中富集，如核仁标记蛋白原纤维蛋白所示；相比之下，G679R-NSUN2在核质中定位错误（图1D）。通过蛋白质印迹证实了WT-NSUN2和G679R-NSUN2在NSUN2 KO细胞中的表达水平相当（图1E）。LS-MS/MS结果表明，WT（而不是G679R-NSUN2）可以恢复小RNA中的m5C水平，其中大多数是tRNA（图1F）。以上结果表明，G679R致使NUSN2在体内定位的错误和失活。
图1 G679R-NSUN2位于核质中，且导致tRNA中m5C减少
为了了解NSUN2的核仁定位是否对tRNA m5C的修饰的意义，作者设计一种模拟G679R-NSUN2核质定位的NSUN2突变体。作者生成了一个NSUN2截短变体，其中最大的预测无序区域被去除（IDR-NSUN2430-500个氨基酸）（图2A）。正如预测的那样，去除无序区后，NSUN2出现了明显的定位错误（图2B）。接下来，作者以同等的水平将WT-和IDR-NSUN2重新表达到NSUN2-KO细胞中。LC-MS/MS结果显示，WT-NSUN2和IDR-NSUN2的表达显著增加了m5C水平，但不影响其他tRNA修饰（图2C-D），表明NSUN2在tRNA上的m5C修饰可以发生在细胞核外。
图2 IDR-NSUN2截短变体位于核质中，部分挽救了tRNA中的m5C水平
由于IDR-NSUN2（细胞质定位）可以恢复小RNA中的大多数m5C，因此G679R的细胞质定位可能不是tRNA低甲基化状态的原因。为了评估NSUN2的催化活性，作者使用重组蛋白与类似于NSUN2底物tRNAGly的RNA寡核苷酸进行了体外甲基化反应（图3A）。LC-MS/MS结果显示，全长WT-NSUN2有效地将m5C写入在该RNA探针中（图3B）。与WT-NSUN2相比，G679R-NSUN2变体未能在RNA寡核苷酸上写入m5C（图3C）。此外，WT-NSUN2以浓度依赖的方式形成蛋白质/RNA复合物，但G679R-NSUN2几乎没有蛋白质-RNA复合物的形成（图3E、F）。这些结果表明，G679R的催化缺陷主要是由于tRNA结合亲和力降低。
图3 G679R-NSUN2突变破坏了的tRNA结合亲和力和催化效率
为了确定NSUN2介导的m5C在tRNA中的安装的生物学功能，作者利用黑腹果蝇作为模型生物，建立了NSUN2 KO的果蝇。作者使用社交空间分析法评估了苍蝇的社交行为，其中苍蝇被放置在一个封闭的垂直三角形腔室中。20分钟后，测量并比较了个体苍蝇之间的距离，以确定它们对社交互动的倾向。Nsun2 KO果蝇表现出更大的社交空间，与野生型果蝇相比，其相互距离增加，社交空间指数降低（图4A-C）。从Nsun2 KO果蝇分离的小RNA（<200 nt）的LS-MS/MS显示m5C水平明显降低（图4D）。而WT-NSUN2的回补缓解了社会空间指数的降低，而突变体G679R-NSUN2对行为表型的回补效果最差（图4E-H）。回补IDR-NSUN2的果蝇部分挽救了行为表型，但与表达WT-NSUN2的果蝇相比，在社会空间分析中显示出显著差异（图4F-H）。
图4 评估果蝇社交互动中tRNA中NSUN2介导的m5C修饰的作用作者随后修改了表达系统，将mClover标签引入NSUN2的N端，能够监测表达mClover-NSUN2细胞的数量。Western印迹显示，mClovertaged WT-NSUN2和IDR-NSUN2具有类似的表达水平（图5A）。结果显示，从mClover-WTNSUN2细胞中提取的大量tRNA的m5C水平明显高于表达mClover-IDR-NSUN2的细胞（5.7%对3.9%）（图5B）。为了研究WT-和IDR-NSUN2是否具有不同的甲基化mtRNA的能力，作者将mClover-WT-NSUN2和mClover-IDR-NSUN 2表达后的细胞裂解物分离为线粒体和细胞质部分。结果表明，mClover-WT-NSUN2的表达将mtRNA中的m5C水平从0.12±0.02恢复到0.49±0.10，而mClover-IDR-NSUN2将m5C水平由0.12±0.02还原到0.33±0.02。这些数据表明，野生型和IDR-NSUN2都在mtRNAs上安装了m5C；mtRNAs在表达WT和IDR-NSUN2的细胞之间呈现不同的m5C水平，m5C水平的差异与大量tRNA中的差异相当。接下来，作者量化了几个特定NSUN2-tRNA靶点的m5C水平。纯化tRNA的LC-MS/MS分析显示，所有选定的tRNA靶标都被mClover-WT-NSUN2和mCloverIDR-NSUN2部分甲基化（图5D和E）。mClover-IDR-NSUN2表达后tRNALeu、tRNAGlu和tRNAGly的甲基化水平显著低于mClover-WT-NSUN2表达后相同tRNA的甲基化程度（tRNALeu为70%对84%：tRNAGlu为41%对73%，tRNAGly为63%对72%）。因此，虽然部分tRNA被WT和IDR-NSUN2甲基化的程度相似，但核质定位的IDR-NSUN 2在特定tRNA上安装m5C方面存在缺陷。为了阐明核质定位对IDR-NSUN2对特定tRNA靶标的中等催化活性的贡献，作者利用了体外甲基化检测。由于重组IDR-NSUN2不稳定，作者使用从NSUN2 KO HEK293T细胞制备的核提取物进行了体外甲基化测定，该核提取物在tRNAGly的生物素化RNA寡核苷酸相似部分上瞬时表达mCloverWT-NSUN2或mClover-IDR-NSUN 2（图5F）。尽管使用的核提取物具有相当浓度的WT-和IDR-NSUN2，但与含有WT-NSUN2的提取物相比，含有IDR-NSUN 2的提取物显示出显著较低的m5C甲基化活性（图5G）。
图5 IDR-NSUN2能够恢复特定tRNA中的m5C水平综上所述，这项工作阐明了认知功能中G679R疾病突变的分子机制，发现tRNA m5C水平与果蝇的认知表现呈正相关，并为tRNA上m5C安装的细胞定位对神经元功能的意义提供了有价值的见解。
文章编号：480
原文链接：
https://doi.org/10.1093/nar/gkae1169
原文引用：
Yulia Gonskikh, Christian Tirrito, Praneeth Bommisetti, Maria Saraí Mendoza-Figueroa, Julian Stoute, Joshua Kim, Qin Wang, Yuanquan Song*, Kathy Fange Liu*. Spatial regulation of NSUN2-mediated tRNA m5C installation in cognitive function. Nucleic Acids Res., 2024, DOI: 10.1093/nar/gkae1169.
