斯坦福大学EST Letters：甲型流感病毒在生牛奶中的感染性和持久性

文摘 2024-12-28 10:35 浙江

甲型流感病毒在生牛奶中的感染性和持久性

摘要

甲型流感病毒带来重要的公共卫生风险，近期奶牛中高致病性禽流感（HPAI）H5N1的爆发引发了对通过饮用生牛奶传播的担忧。本研究调查了甲型流感病毒H1N1 PR8（IAV PR8）在4°C的生牛奶中的持久性。我们发现一阶衰减速率常数为-2.05/day，病毒可在生牛奶存活约2.3天。病毒RNA至少在57天内仍可检测到且无降解。巴氏杀菌（63°C，30分钟）将感染性病毒降低至不可检测水平，并降低了病毒RNA浓度。这些发现凸显了通过饮用生牛奶传播人畜共患病毒的潜在风险，并强调了牛奶巴氏杀菌的重要性。生牛奶和巴氏杀菌牛奶中病毒RNA的长时间持久性对食品安全评估和环境监测具有重要意义，特别是在流感病毒的环境监测背景下。

关键词

甲型流感；牛奶；持久性；感染性；禽流感

1. 研究背景

甲型流感的公共卫生风险及现状

- 甲型流感是全球范围内导致死亡和发病的主要原因之一。据世界卫生组织估计，每年它会造成多达65万人死亡以及10亿例感染病例。在美国，甲型流感每年约导致4100万感染病例和5.1万死亡病例，感染人群约占美国总人口的8%，并且每年造成约112亿美元的经济损失。

- 甲型流感具有高突变率和人畜共患的潜力，这使得预防措施的制定面临挑战。2009年的H1N1流感大流行（“猪流感”）就是一个例证，该病毒由猪传播给人类，在2009 - 2010季节估计造成了7亿至14亿例感染。

高致病性禽流感H5N1的相关情况

- 高致病性禽流感H5N1（HPAI）表现出与2009年H1N1病毒相似的基因重组和人畜共患传播特性，近期在美国及全球引起了广泛关注。自2022年以来，H5N1分支2.3.4.4已影响超过1亿只家禽，截至2024年10月6日，已感染243个牛群，实现了跨物种传播，此前在2024年之前，牛感染H5N1的情况尚未有记录。

- 在美国多个州的巴氏杀菌牛奶产品中检测到了H5N1的遗传物质，这与废水检测结果相关联，提示公共卫生官员附近可能存在感染牛群。然而，目前尚无研究检测巴氏杀菌对牛奶中甲型流感病毒RNA的影响，而这一信息对利用废水追踪H5N1的传播将非常有用。

生牛奶消费与流感病毒研究现状

- 尽管有研究表明巴氏杀菌可有效灭活牛奶中的流感病毒，但仍有部分人群消费生牛奶。2019年美国农业部的调查显示，4.4%的美国人每年至少消费一次生牛奶，1.6%（约500万人）每月消费一次。

- 通过文献综述发现，没有研究记录生牛奶中感染性病毒的持久性，关于巴氏杀菌对生牛奶中甲型流感感染性影响的研究也有限，其中两篇为未经同行评审的预印本。考虑到生牛奶消费情况以及与生牛奶消费相关疾病爆发的增加趋势，了解甲型流感病毒在牛奶中的持久性对评估牛奶消费和环境暴露途径相关的感染风险具有重要意义。

2. 实验方法

- 病毒培养与纯化：使用Madin Darby犬肾（MDCK）细胞培养IAV PR8病毒，通过超速离心纯化和浓缩病毒。

- 病毒在生牛奶中的持久性实验：将纯化的IAV PR8以1:10的比例加入到4°C储存的生牛奶中，在0、1、3、5、7、21、28、35和57天分别取样，进行组织培养感染剂量（TCID₅₀）测定和RNA提取，以测量病毒的感染性和RNA浓度。

- 巴氏杀菌实验：将加有IAV PR8的生牛奶在63°C下加热30分钟，模拟巴氏杀菌过程，在加热前后取样进行RNA提取，以确定巴氏杀菌对病毒RNA浓度的影响；另一实验则通过TCID₅₀测定来量化巴氏杀菌对传染性IAV的影响。

- 病毒滴度测定（TCID₅₀）：使用MDCK细胞通过TCID₅₀测定来量化活病毒。

- 核酸提取和病毒RNA定量：使用ZymoBIOMICS DNA/RNA miniprep试剂盒提取核酸，通过逆转录微滴数字聚合酶链反应（RT-ddPCR）定量病毒RNA。

3. 研究结果

- 巴氏杀菌对甲型流感病毒感染性的影响：63°C 30分钟的巴氏杀菌可使生牛奶中的传染性IAV降至不可检测水平。

- 甲型流感病毒在生牛奶中的感染性持久性：在4°C下，IAV PR8在生牛奶中的感染性在5天内衰减至低于检测限，其衰减速率常数k_{infectivity}为-2.05 ± 0.45 天^–1，达到99%感染性降低（T_{99}）需要2.3天，而生牛奶中背景微生物可能导致其衰减速率高于其他水性基质中的流感病毒衰减速率。

图 2.测量的生牛奶样品（蓝色）、巴氏杀菌样品（红色）和阴性无模板对照（绿色）中流感的浓度（以每毫升牛奶的基因拷贝数为单位）。每个条形代表一个生物学仿行，误差条形代表 95% 置信区间。发现所有阴性对照均为阴性。

- 甲型流感病毒在生牛奶中的RNA持久性：IAV PR8核酸在4°C的生牛奶中可检测且稳定存在至少57天，其衰减速率常数k_{RNA}为-0.00049 (p = 0.709) day^{-1}，与0无显著差异；巴氏杀菌后，病毒RNA浓度从生牛奶中的平均2.9×10^{8}拷贝/mL显著降低至9.1×10^{7}拷贝/mL，减少了70%。

4. 研究意义与局限

- 研究意义：本研究表明甲型流感病毒在生牛奶中可保持感染性，强调了生牛奶消费的风险，为公共卫生官员提供了风险评估依据，也为环境科学家和工程师在流感环境检测方面提供了参考；同时，病毒RNA在生牛奶和巴氏杀菌牛奶中的长时间持久性对食品安全评估和环境监测有重要意义，特别是在流感病毒环境监测方面。

- 研究局限：本研究测量的是外源性人类IAV在生牛奶中的衰减，而感染HPAI H5N1的奶牛所产牛奶中内源性病毒的衰减可能受牛奶中抗体的影响，这需要进一步研究。

Zulli, A., Zhang, M., Jong, S., Blish, C., & Boehm, A. B. (2024). Infectivity and Persistence of Influenza A Virus in Raw Milk. Environmental Science & Technology Letters, 11(1), 10-16. https://doi.org/10.1021/acs.estlett.4c00971

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