浙江中医药大学生命学院EHP：有机磷阻燃剂与代谢紊乱：一项针对脂联素受体的计算机模拟、体外和体内研究

文摘 2024-12-18 17:00 浙江

摘要

背景：

环境化学物质暴露与代谢结果相关，通常其与核激素受体的结合被认为是许多结果的分子起始事件（MIE）。然而，需要更多研究来了解此类暴露对细胞膜结合的脂联素受体（AdipoRs）的影响，AdipoRs是关键的代谢调节因子。

目的：

本研究旨在阐明AdipoRs与环境化学物质，特别是有机磷阻燃剂（OPFRs）之间的潜在相互作用及其产生的影响。

方法：

采用计算机模拟、细胞热位移和非竞争性结合测定法，筛选了8种OPFRs与AdipoR1和AdipoR2的相互作用。在肝细胞模型中测试了OPFR暴露后AdipoR调节的两个关键事件。使用毒理学优先指数（ToxPi）评分方案根据OPFR破坏AdipoR相关代谢的潜力对其进行排名。进一步在小鼠模型中研究了OPFRs对AdipoR信号激活的抑制作用。

结果：

分析表明，芳基OPFRs（2-乙基己基二苯基磷酸酯、磷酸三苯酯和磷酸三甲苯酯）与AdipoR1和AdipoR2的跨膜腔之间存在π-π堆积和π-硫相互作用。细胞热位移测定显示，这三种化合物暴露后AdipoR蛋白的熔解曲线向右移动>3°C。尽管结合位点与脂联素不同，但结果表明芳基OPFRs非竞争性抑制内源性肽配体ADP355与受体的结合。对AdipoR调节的关键事件分析显示，暴露于芳基OPFRs的细胞中葡萄糖摄取显著降低，而脂质含量较高。根据ToxPi评分，EHDPP、TCP和TPhP被列为前三位干扰物。在野生型（WT）小鼠中也观察到这些芳基OPFRs与AdipoRs之间的非竞争性结合。在db/db小鼠中，注射ADP355后血糖水平降低的现象在典型芳基OPFR（TCP）存在时减弱。暴露于TCP的WT小鼠表现出较低的AdipoR1信号，其特征是磷酸化AMP活化蛋白激酶（pAMPK）降低和糖异生相关基因的表达增加。此外，暴露于ADP355的WT小鼠表现出较高水平的pAMPK蛋白和过氧化物酶体增殖物激活受体-α信使RNA。这伴随着较高的葡萄糖处置和较低水平的长链脂肪酸及肝甘油三酯；这些代谢改善在TCP共同处理时被抵消。

结论：

计算机模拟、体外和体内实验表明，芳基OPFRs作为AdipoRs的非竞争性抑制剂，阻止其被脂联素激活，从而作为这些受体的拮抗剂发挥作用。本研究描述了化学诱导代谢紊乱的一种新的MIE，并强调了环境对代谢健康影响的新途径。

主要内容

1. 引言

- 人为化合物，特别是内分泌干扰化学物质（EDCs），对全球代谢综合征日益流行的影响受到关注，EDC相关代谢紊乱的机制是全球重要研究课题。

- 核受体在EDC引发代谢紊乱中的作用已被广泛研究，但膜受体在其中的作用仍不清楚。

- 有机磷阻燃剂（OPFRs）是典型的EDCs，其代谢毒性主要通过核受体介导，但膜受体在OPFR诱导代谢失调中的作用尚待探索。

- 脂联素通过AdipoR1和AdipoR2调节代谢稳态，本研究旨在评估OPFRs与AdipoRs的结合潜力及其影响。

2. 材料和方法

- 分子对接和动力学模拟：获取AdipoRs的X射线结构，进行配体结构绘制和分子对接，通过分子动力学模拟评估复合物稳定性。

- 细胞热位移测定（CETSA）：利用CETSA原理，在体外和体内检测OPFRs对AdipoR1和AdipoR2蛋白热稳定性的影响。

- 基于细胞的FITC-配体非竞争性结合测定：构建荧光标记的配体FITC-ADP355，检测OPFRs与AdipoRs的非竞争性结合，构建AdipoR1或AdipoR2敲低细胞系以研究结合亲和力。

- 评估小鼠肝细胞中葡萄糖摄取和细胞内脂质积累：用OPFRs处理小鼠肝细胞，检测葡萄糖摄取和脂质积累，以AdipoR敲低细胞为对照，用AdipoRon和ADP355作为阳性对照。

- 毒理学优先指数（ToxPi）评分计算：将五个测试实验结果纳入ToxPi模型，计算并排名OPFRs破坏AdipoR依赖性代谢稳态的能力。

- 实时逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）：提取RNA，反转录为cDNA，进行RT-qPCR检测基因表达。

- 蛋白质免疫印迹（Western Blotting）：提取细胞或组织蛋白，进行免疫印迹分析，检测相关蛋白水平。

- 气相色谱串联质谱法测定脂肪酸：用该方法测定小鼠肝组织中的脂肪酸水平。

3. 结果

- 分子对接和动力学模拟：发现OPFRs与AdipoR1和AdipoR2的潜在结合模式，芳基OPFRs与AdipoR1的结合亲和力较高，结合位点主要在跨膜螺旋和细胞外环。

图1. 脂联素受体（AdipoRs）与三种芳基有机磷阻燃剂（aryl-OPFRs）的分子对接和分子动力学模拟。AdipoRs的晶体结构在卡通模型中显示为七个螺旋。带框的插图展示了配体在（A）AdipoR1和（B）AdipoR2空腔中的位置。氢键、π - π堆积、盐桥、卤键和疏水相互作用等特征以彩色虚线显示。AdipoR1（A）和AdipoR2（B）与三种芳基 - OPFRs相互作用的分子动力学模拟，以及（C）在20纳秒分子动力学模拟中AdipoRs配体的均方根偏差（RMSD）变化。相应数据列于Excel表S1中。用于分子对接的AdipoR1和AdipoR2的三维结构取自蛋白质数据库（PDB）。使用AutoDock Vina软件（版本1.1.2），我们将这些三维结构转换为二维表示，调整颜色，并标记AdipoRs的不同部分以生成（A）和（B）。注：2D，二维；3D，三维；AdipoR1，脂联素受体1；AdipoR2，脂联素受体2；CP，细胞质区域；EHDPP，2 - 乙基己基二苯基磷酸酯；ICL，细胞内环；LB，脂质双层；OPFR，有机磷阻燃剂；TCP，磷酸三甲苯酯；TM，跨膜；TPhP，磷酸三苯酯。

- OPFRs暴露后细胞裂解物热稳定性的变化：CETSA实验表明，芳基OPFRs可增强AdipoR1和AdipoR2的热稳定性，使熔解曲线右移，其他OPFRs对AdipoR2热稳定性影响较小或无影响。

- FITC-ADP355与OPFRs对AdipoRs的非竞争性结合检测：非竞争性结合实验显示，芳基OPFRs和TCPP可抑制FITC-ADP355与AdipoRs的结合，构建的AdipoR1或AdipoR2敲低细胞系表明ADP355对AdipoR1亲和力较高。

- OPFRs对AML 12细胞脂质积累和葡萄糖摄取的影响：OPFRs处理导致细胞脂质积累增加、葡萄糖摄取降低，AdipoR激动剂可增加葡萄糖摄取，ToxPi评分显示芳基OPFRs对AdipoR干扰能力较强。

图 4.暴露于 OPFRs 的 AML 12 细胞的脂质积累和葡萄糖摄取。（A） OPFRs 对脂肪生成的影响（𝑛=3/组）和（B）葡萄糖摄取（𝑛=4/组）在不同治疗时间。用不同浓度的 OPFRs 处理细胞 12 h 或 24 h。用 BODIPY 493/503 （1μ⁢M）和 Hoechst 33324 （1μ⁢M).圆圈的颜色表示𝑝-值，圆圈的大小表示与载体对照（设置为 1.0）相比的相对脂质面积。

- 芳基OPFRs暴露后野生型小鼠AdipoRs的热稳定性及对db/db小鼠葡萄糖处置的影响：体内实验中，急性注射芳基OPFRs后，小鼠AdipoR蛋白水平无明显变化，但加热后蛋白水平降低，TCP预处理可减弱ADP355对db/db小鼠葡萄糖处置的促进作用。

- 典型芳基OPFR TCP对野生型小鼠糖脂代谢和信号转导的影响：短期共暴露研究显示，TCP可逆转ADP355对小鼠血清甘油三酯、葡萄糖耐量、肝甘油三酯和脂肪酸水平的影响，抑制AdipoR1下游信号通路。

4. 讨论

- OPFRs可能通过与AdipoRs结合影响代谢，芳基OPFRs与AdipoRs的结合模式和对其结构稳定性的影响表明它们可能作为拮抗剂发挥作用。

- 体外和体内实验结果表明，芳基OPFRs对AdipoRs的抑制作用影响糖脂代谢，可能与葡萄糖代谢和脂肪酸合成等机制有关。

- 长期暴露于芳基OPFRs可能对代谢产生风险，尤其是在脂联素缺乏的生物体中，虽然短期暴露TCP不改变AdipoR mRNA水平，但长期影响可能更复杂。

- 人类暴露于OPFRs的残留水平与糖脂代谢相关，本研究结果提示OPFRs对AdipoR信号的干扰可能导致糖脂代谢紊乱，但研究存在局限性，如缺乏阳性对照和不能排除其他未知机制。

引用该文献

Liu, Y., Ma, X., Le, Y., Feng, J., Xu, M., Wang, W., & Wang, C. (2024). Organophosphorus Flame Retardants and Metabolic Disruption: An in Silico, in Vitro, and in Vivo Study Focusing on Adiponectin Receptors. Environmental Health Perspectives, 132(11), 117003. https://doi.org/10.1289/EHP14634

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