|中国药科大学|新污染物分析技术：直接进样 UPLC-MSMS 方法分析废水中的 77 种化合物

文摘 2024-12-23 23:18 浙江

研究背景

- 全球毒品滥用问题对公共健康构成重大威胁，近几十年来，新精神活性物质（NPS）的快速出现使非法药物市场形势更加严峻。各国政府致力于动态监测毒品滥用的模式、规模和趋势，废水流行病学（WBE）作为一种有效的方法应运而生，通过分析废水成分来监测非法药物使用情况，其概念于2001年提出，2005年在意大利首次应用，如今已成为全球实时、客观、便捷的监测手段。

- 废水分析技术在WBE中的应用广泛，涵盖了非法成瘾物质（如阿片类、芬太尼类、大麻、可卡因、NPS等）、合法成瘾物质（如茶、咖啡、酒精等）、药物（如降压药等）、其他人类消费化学品（如维生素、甜味剂等）以及人类内源性物质。这些物质通过尿液和粪便排出体外，进入污水系统，最终到达污水处理厂。检测废水中的相关物质能为健康、生活习惯、卫生事件和社会问题提供全面评估，其结果经标准化后可用于不同国家和地区间的比较，有助于深入了解物质消费和滥用模式的变化，为评估居民健康状况、协助政策制定提供依据。

- 目前，废水分析最常用的方法是超高效液相色谱 - 串联质谱（UPLC - MS/MS）结合固相萃取（SPE），SPE虽能浓缩目标化合物并降低背景干扰，但存在诸多局限性，如单一小柱无法富集所有化合物，使用多个不同性质小柱会增加成本、时间和预处理复杂性。因此，直接进样（DI）技术成为研究方向，已有学者探索其在检测废水中NPS、非法药物、抗生素和常见药物等方面的应用，但当前直接进样方法在可检测物种数量和检测限方面存在不足，鉴于新毒品不断出现，有必要扩大废水分析的目标化合物范围，本研究旨在开发并验证一种可检测77种目标化合物的直接进样方法，并评估其与SPE方法的优劣。

实验部分

1. 材料与试剂

- 本研究纳入77种分析物，分为两组。Group A包含在常规废水监测中呈现高浓度水平（\(\mu g L^{-1}\)）的人类生物标志物，如乙基硫酸盐（EtS）、可替宁、OH - 可替宁、咖啡因、副黄嘌呤、1,7 - 二甲基尿酸（1,7 - DUA）、茶碱、1 - 甲基黄嘌呤（1 - X）、可可碱（3,7 - X）、1,3,7 - 三甲基尿酸（TUMA）、乙酰磺胺酸钾、5 - 羟基吲哚乙酸（5 - HIAA）、1 - 甲基 - 2 - 吡啶酮 - 5 - 甲酰胺（2 - PY）、4 - 吡啶酸（4PA）、美托洛尔酸（MPA）等；Group B则包括在废水中浓度较低（\(ng L^{-1}\)）的非法药物和NPS。所有化合物信息及内标选择依据详见表S1，内标选择综合考虑了多种因素，部分化合物缺乏合适内标时，根据其理化性质、保留时间、基质效应和回收率等，选用实验室可获取的其他合适化合物内标替代，具体对应关系见表S2。试剂方面，HPLC级甲醇购自Merck（德国达姆施塔特），甲酸购自Thermo Fisher Scientific（美国马萨诸塞州），醋酸铵（>98%）购自Sigma - Aldrich（美国密苏里州），超纯水由Milli - Q® IQ 7000纯化系统（美国Millipore公司）制备，其他试剂均为最高质量等级。

2. 样品采集

- 于2023年9月至12月期间，在工作日和周末从25个污水处理厂（WWTPs，服务人口约5万至100万）采集废水。采用连续流比例采样技术获取24小时综合进水废水，将所有样品置于 - 20°C的聚乙烯对苯二甲酸酯（PET）瓶中冷冻保存，随后运输至实验室，并在 - 40°C下储存直至分析。用于方法优化和验证的十个空白基质取自中国七个主要地理区域的废水样品，这些样品背景干扰极小。

3. 样品预处理

- 直接进样方法：样品在4°C解冻后，取950μL加入50μL浓度为1ng/mL的混合内标（Group A最终浓度为1000ng/L，Group B为50ng/L），然后用0.2μm PTFE滤膜（德国Waldbronn的Agilent Captiva）过滤，滤液用于UPLC - MS/MS分析，每个废水样品均进行平行分析。

图 1.直接进样（DI）和固相萃取（SPE）方法的流程图。

- SPE方法：本研究选用两种常见的SPE小柱，Waters Oasis PRIME HLB（3cc，60mg，美国Milford）和Waters Oasis PRIME MCX（3cc，60mg，美国Milford）进行萃取。样品解冻后充分摇匀，用GE GF/C玻璃微纤维滤膜（英国Kent的GE Whatman）过滤，制备双份平行样品。每份50mL过滤后的废水加入100μL浓度为25ng/mL的混合内标（Group A最终浓度为1000ng/L，Group B为50ng/L）。对于HLB小柱，需确保过滤后废水样品pH为7，以4mL/min流速萃取分析物，然后用4mL纯水洗脱（流速2mL/min），最后用4mL甲醇洗脱（流速1mL/min）；对于MCX小柱，将50mL过滤后的废水样品酸化至pH 2，以4mL/min流速萃取分析物，随后用4mL甲醇洗涤（流速2mL/min），再用4mL含5%氨的甲醇洗脱（流速1mL/min）。洗脱液在55°C下用真空离心装置蒸发至近干，用200μL含0.01%甲酸和1mM甲酸铵的超纯水复溶，最后通过0.2μm PTFE滤膜过滤，进行UPLC - MS/MS分析。

4. UPLC - MS/MS方法

- 分析采用超高效液相色谱系统ACQUITY UPLC（美国Waters公司）和带有电喷雾电离（ESI）源的Waters Xevo TQ - XS三重四极杆质谱仪。色谱分离使用Waters ACQUITY UPLC®HSS T3柱（100×2.1mm内径，1.8μm粒径），流动相A为含0.01%甲酸和1mM甲酸铵的超纯水，流动相B为甲醇，采用梯度洗脱程序：0 - 0.5min，5%B；0.5 - 3.0min，从5%线性增加至27%B；3.0 - 4.5min，从27%线性增加至40%B；4.5 - 6.5min，从40%线性增加至100%B；6.5 - 8min，100%B；8.0 - 8.1min，从100%线性降低至5%B；8.1 - 10.5min，5%B，总运行时间10.5min。进样体积为10μL，流速0.4mL/min，柱温保持在40°C。离子源参数为：毛细管电压0.5kV；离子源温度150°C；去溶剂气流量1000L/h；锥孔气流量150L/h；去溶剂气温度650°C；碰撞气流量0.15mL/min。质谱仪采用正负电喷雾电离和多反应监测（MRM）模式，所有化合物的MRM跃迁（m/z）、锥孔电压（CV）和碰撞能量（CE）见表S2，数据采集和处理使用Masslynx V4.2软件。

5. 方法验证

- 按照国际人用药品注册技术协调会（ICH）指南评估方法性能，包括选择性、线性范围、检出限（LOD）、定量限（LLOQ）、准确度、精密度（日内和日间）、基质效应和过滤损失。

- 选择性、线性、LOD和LLOQ：通过测试来自不同WWTPs的六个空白基质和六个标准加标样品来研究方法的选择性。用空白废水基质配制含77种目标化合物的混合标准工作溶液，建立标准校准曲线，采用加权因子为1/X的最小二乘法进行线性回归。LOD定义为信噪比（S/N）至少达到3:1时的浓度，LLOQ定义为S/N达到10:1时的浓度。

图 3.浓度为 250 ng L 的 DI 法 77 种目标化合物的定量离子流色谱图 ^–1（B 组）和 1000 ng L ^–1（A 组）。

6. 直接进样方法与离线SPE方法对比

- 选用HLB和MCX小柱作为最常见的SPE方法代表，与直接进样方法进行对比。通过向六个空白基质中添加低、中、高浓度（Group A为300、4000、8000ng/L，Group B为30、100、200ng/L）的标准工作溶液，比较两种方法的基质效应和回收率。由于SPE方法的优势在于低LLOQ，直接进样方法的挑战也在于LLOQ，因此特别对比了低浓度加标样品（如可替宁和咖啡因浓度为300ng/L；MDA、可待因、曲马多、去甲乙酰芬太尼和蒂巴因浓度为30ng/L；其他化合物浓度为10ng/L）的检测情况。

结果与讨论

1. 目标化合物选择

- 本研究选定的77种目标化合物涵盖多种类型，包括常见非法成瘾物质（如阿片类、苯乙胺类、苯环利定类、可卡因类等）、合法成瘾物质（如咖啡因等）、药物（如降压药、镇静催眠药等）、其他人类消费化学品（如甜味剂、维生素等）以及人类内源性物质。其中，尼古丁代谢物（可替宁和OH - 可替宁）、甜味剂（乙酰磺胺酸钾）、酒精代谢物（EtS）、咖啡因及其代谢物、维生素、内源性物质（5 - HIAA）和美托洛尔代谢物（MPA）等不仅用于评估各自的消费水平，还作为人类生物标志物动态监测人群。此外，还包括在中国受全面管制的芬太尼类和合成大麻素类物质，以及部分在其他国家出现的NPS，如赛拉嗪、艾司唑仑、尼美西泮和依托咪酯等。

2. 方法优化

- UPLC方法优化：离子强度、pH和流动相组成等因素对UPLC分析中的保留时间、峰形和分析物分离有显著影响。研究探索了多种有机和水相流动相组合，包括甲醇和乙腈，以及不同比例的甲酸和甲酸铵水溶液。结果表明，在水相为0.01%甲酸和1mM甲酸铵时，38种目标分析物响应最强，31种化合物响应次之。对于咖啡因代谢物副黄嘌呤和茶碱（互为异构体且离子对相同），甲醇能实现分离，乙腈则不能，且77种化合物在甲醇中分离效果更好，停留时间更合适，因此选择甲醇作为有机相，确定了最佳流动相组成。

- MS方法优化：对仪器参数（如毛细管电压、去溶剂气温度、去溶剂气流量和锥孔气流速）进行优化，逐个调整参数并保持其他参数不变。随着毛细管电压从2.5kV降低至0.5kV和锥孔气流速从350L/h降低至150L/h，响应增强，但过低值会增加电离效率低和仪器污染风险；去溶剂气温度从450°C升高至650°C和流量从800L/h增加至1000L/h时响应更好，但过高值可能损坏仪器。综合优化结果，确定了使90%化合物获得最佳响应的参数组合（毛细管电压0.5kV、去溶剂气温度650°C、去溶剂气流量1000L/h、锥孔气流速150L/h），确保了检测的准确性和灵敏度。

- 滤膜选择：鉴于废水样品过滤在直接进样方法预处理中的关键作用，研究对比了三种不同滤膜（聚四氟乙烯滤膜PTFE、再生纤维素滤膜RC、聚醚砜滤膜PES）的回收效果。结果显示，PTFE滤膜使88.31%化合物回收率在80% - 120%，而RC和PES滤膜在此范围内的化合物比例分别为80.52%和67.53%，因此选择PTFE滤膜以减少废水样品过滤过程中的损失。

- 内标选择：本研究基于保留时间、基质效应、回收率和分析物的理化性质等综合因素为化合物选择内标，部分化合物缺乏合适内标时，采用外标法替代，并在结果分析中考虑基质效应和回收率的影响，具体内标选择情况见表S2。

3. 方法验证

- 选择性、线性、LOD、LLOQ、准确度和精密度：通过对不同空白基质和加标样品的分析，确认了方法在定性分析中的无干扰性，77种目标化合物在10.5min内均出峰。各化合物线性范围不同，15种为100ng/L - 10,000ng/L，25种为1ng/L - 250ng/L等，校准曲线线性良好（\(r^{2}>0.99\)）。LOD范围为0.5ng/L - 80ng/L，LLOQ范围为1ng/L - 100ng/L，其中65种化合物LLOQ在1ng/L - 10ng/L之间，反映了化合物对仪器的不同敏感度。方法在低、中、高浓度下的准确度（80.73% - 114.97%）、日内精密度（0.44% - 14.91%）和日间精密度（1.62% - 14.70%）均良好，具体数据见表S3。

- 基质效应和回收率：基质效应在使用外标法时，三个浓度水平下范围为76.36% - 266.33%；使用内标法时，范围为90.72% - 158.17%，约74%分析物基质效应可忽略（90% - 110%），其他存在离子抑制或增强现象，使用同位素内标可有效校正。回收率在三个验证水平下，多数化合物为74.87% - 114.58%，但部分合成大麻素（如4 - OH - MiPT、MDMB - 4en - PINACA等）回收率较低（27.90% - 66.52%），可能与其不稳定性和吸附性有关，具体数据见表S4和S5。

4. 直接进样与SPE方法对比

- 基质效应和回收率：对比直接进样法（HLB和MCX小柱）与SPE法，发现SPE过程中部分化合物（如EtS、可替宁等）存在显著损失（接近100%），而直接进样法对这些化合物回收率为91.37% - 106.93%，适用于高浓度化合物检测。对于合成大麻素，MCX小柱因pH 2条件下处理导致其损失99%，而直接进样法可避免此问题。三个浓度水平下，HLB、MCX和直接进样法对77种化合物的平均回收率分别为70.47%、70.02%和90.93%，直接进样法涵盖化合物范围更广。统计分析表明，高、中浓度下SPE与直接进样法基质效应无显著差异，低浓度时有显著差异（HLB与直接进样：\(P = 0.0023\)；MCX与直接进样：\(P = 0.0013\)），且SPE法基质效应离散度大于直接进样法，可能源于SPE预处理复杂导致的分析物保留不完全、洗脱不充分及浓缩蒸发过程中的损失等因素，同时内标选择也可能影响基质效应和回收率结果，具体数据见图4和表S6、S7。

- 加标样品检测：计算低浓度下三种预处理方法检测与加标浓度间的相对误差（RE），仅对有内标的32种化合物进行分析（确保结果可靠性），发现HLB、MCX和直接进样法的平均RE分别为 - 5.22%、 - 5.80%和0.24%，直接进样法准确度优于SPE法（HLB与直接进样：\(P = 0.0018\)；MCX与直接进样：\(P = 0.0004\)）。此外，直接进样法无富集浓缩步骤，线性范围更宽，对于废水中高浓度结果与讨论（续）

此外，直接进样法无富集浓缩步骤，线性范围更宽，对于废水中高浓度的化合物（如可替宁和咖啡因），SPE处理后可能导致仪器饱和和污染，而直接进样法可作为常规废水监测中SPE方法的替代选择，具体数据见图5。

方法应用

- 应用开发的直接进样方法分析中国25个WWTPs的废水样品，在77种目标化合物中，有39种在进水样品中被检出。其中，14种化合物（如EtS、可替宁、OH - 可替宁、咖啡因、TUMA、茶碱、副黄嘌呤、1,7 - DUA、3,7 - X、1 - X、乙酰磺胺酸钾、MPA、4 - PA、2 - PY）检出率达100%，可作为酒精、烟草、咖啡、茶、甜味剂和内源性代谢物的生物标志物，其平均浓度范围为552.87ng/L - 9369.08ng/L，与中国先前报道的可替宁、咖啡因和EtS浓度相符。

- 伪麻黄碱作为广泛使用的非处方药，主要以原型排出，检测到的浓度最高（116.10ng/L - 549.05ng/L），甲基卡西酮的检出可能与其与伪麻黄碱和麻黄碱的相互转化有关。阿片类药物（如吗啡、可待因、曲马多和羟考酮）浓度范围为0ng/L - 82.95ng/L，但合法药用吗啡的存在对海洛因滥用监测构成挑战，因其可能影响海洛因浓度并引入不确定性。

与前人研究对比

- 与先前研究相比，本研究的直接进样方法在注射体积、LLOQ和操作时间等方面具有一定特点。本研究中直接进样方法的LLOQ为1ng/L - 100ng/L，与先前采用MCX、HLB和磁性SPE小柱研究中1ng/L - 70ng/L的LLOQ范围相当。尽管SPE能提供更低LLOQ和化合物富集，但操作繁琐耗时，适用性有限。随着分析仪器灵敏度提高，直接进样方法不断发展，此前直接进样方法检测范围有限、类型少，注射体积10μL - 1mL，检测时间8.5 - 18.5min，LLOQ为0.5ng/L - 195.3ng/L。本研究直接进样方法注射体积仅10μL，检测时间10.5min，显著拓宽检测范围至77种目标化合物，涵盖多种重要类别，为废水监测提供更全面的分析手段，具体数据见表2。

- 目前直接进样与SPE方法对比研究有限，现有文献多集中于直接进样与HLB小柱对比，且研究化合物多为非管制物质。本研究聚焦于管制化合物，通过对比直接进样、HLB和MCX三种预处理技术对17种非管制和60种管制化合物的基质效应和回收率，并评估32种化合物内标法的准确度，提出了一种高效的废水药物监测检测方法，为直接进样方法的广泛应用提供了有力支持。

结论

- 本研究成功建立了直接进样UPLC - MS/MS方法，用于分析废水中77种化合物（包括非法药物、NPS、人类生物标志物及其代谢物），方法优化和验证结果证实其可靠性。

- 与使用HLB和MCX小柱的SPE方法相比，直接进样方法在检测加标样品时具有基质效应低、回收率高、相对误差小等优点，且操作简便高效，是废水样品预处理中更快速的替代方法。

- 该方法在中国25个WWTPs废水样品分析中的成功应用，证明其在非法药物、潜在非法药物和人类生物标志物日常监测中的有效性，为废水药物监测提供了一种高通量、省时且准确可靠的检测方法，有助于提升监测水平，加强对药物滥用的监控和管理。

文献链接：1-s2.0-S0021967324009683-main.pdf

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