西安蓝晓科技新材料股份有限公司
苏州蓝晓生物科技有限公司
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提质增效——动物疫苗层析纯化提升产品竞品力
我国动物疫苗行业经历了高速发展的十余年：由最初的28家企业发展到目前105家，产品由最初的10余种发展到目前的400余种。但行业产品同质化严重的问题也愈发突出，导致国内动物疫苗企业竞争异常激烈。根据数据，2019年销售额前10名企业销售额占国内市场份额的59.77%，而其余90余家企业则分摊剩余40.23%的市场，大量企业年销售额不足1亿元。
我国动物疫苗业产能严重过剩，市场上动物疫苗产品的供给能力远大于需求，绝大多数生产企业产能利用水平处在较低的位置。根据数据，2019年，活疫苗产能利用率25.42%，灭活疫苗产能利用率25.30%。（数据来源：公开资料整理）
动物疫苗行业市场竞争激烈，产能过剩！提质增效是动物疫苗企业提升竞争力的主要方式，在产品提质方面通过层析纯化提升产量质量为主要方式。下面来介绍各种动物疫苗层析纯化方式。
猪蓝耳灭活疫苗层析纯化工艺
澄清的蓝耳病毒溶液经多模式层析Seplife Suncore 700一步层析纯化，蛋白去除率可达75%,抗原回收率大于80%，已为4家客户提供了工业生产层析纯化解决方案。
多模式层析填料Sepllife Suncore 700/400属于壳层技术(结构示意如图1），外层5um的惰性层上面分布着700/400KDa的孔道，而内核活性区域既有阴离子交换作用又有疏水作用力，在病毒流经柱床时，大分子病毒和惰性的壳层没有相互作用力且无法通过惰性层上孔道进去活性区域，通过填料颗粒的间隙（即外水体积）直接流穿，而其它杂质如HCP,HC-DNA,HC-RNA则通过柱床时，从惰性层的孔道进入活性区域并以静电力和疏水作用力结合在填料内核中，从而实现很高的上样量，同时使病毒和杂质分离。
图1：蓝晓科技壳层多模式填料结构示意图
图2,3:蓝晓科技多模式层析填料在客户现场使用
蓝耳灭活疫苗纯化结果：
Seplife Suncore 700用于蓝耳弱毒活疫苗纯化
图4：Seplife Suncore 700纯化蓝耳弱毒活疫苗色谱曲线
层析结果：一步层析后，病毒回收率大于80%，蛋白去除率大于80%，满足动物疫苗工艺要求。
蓝晓科技为蓝耳疫苗提供相关产品：
1.细胞培养微载体：Seplife LX-MC-Dex1
2.层析纯化解决方案及层析填料：Seplife Suncore 700
图5：蓝耳疫苗制备工艺流程
更多关于蓝耳疫苗纯化工艺解决方案，请联系蓝晓科技：0512-65160522
猪流感病毒灭活疫苗层析纯化工艺
猪流感病毒灭活纯化工艺过程同蓝耳灭活疫苗纯化过程，澄清的病毒溶液用多模式层析Seplife Suncore 700或凝胶过滤层析Seplife 4FF一步层析纯化即可满足疫苗制备要求。蓝晓科技已为2家客户提供了猪流感疫苗工业生产纯化解决方案。
猪流感疫苗纯化案例：（Seplife Suncore 700)
图6：猪流感疫苗用Seplife Suncore 700纯化色谱图
纯化结果：采用蓝晓Seplife Suncore 700多模式填料对猪流感病毒疫苗进行纯化，达到了很好的纯化效果，病毒活性收率达80%以上，蛋白去除率80%以上。
更多关于猪流感疫苗纯化工艺解决方案，请联系蓝晓科技：0512-65160522
猪腹泻疫苗层析纯化工艺
猪腹泻，猪胃肠炎二联苗，澄清的病毒溶液用多模式层析Seplife Suncore 700或凝胶过滤层析Seplife 4FF一步层析纯化即可满足疫苗制备要求。蓝晓科技已为2家客户提供了猪腹泻疫苗制备Vero细胞及ST细胞培养的微载体及纯化工艺解决方案及纯化填料。
图7：猪腹泻，胃肠炎二联合苗制备工艺流程
更多关于猪腹泻疫苗纯化工艺解决方案，请联系蓝晓科技：0512-65160522
猪圆环二型病毒灭活疫苗
澄清的病毒溶液用蓝晓科技特种超大孔离子交换层析填料Seplife LXPM Q400一吸附洗脱层析纯化后即可满足疫苗制备要求，蓝晓科技已为三家客户提供了工业生产规模纯化工艺解决方案及层析填料。
猪圆环二型病毒疫苗纯化结果
图7：蓝晓科技Seplife LXPM Q400纯化PCV2色谱曲线
纯化样品活性检测如下表：
纯化结果：采用蓝晓Seplife LXPM Q400超大孔填料对猪圆环病毒颗粒进行纯化，达到了很好的纯化效果，病毒活性收率达85%以上。
更多关于猪圆环二型病毒灭活疫苗纯化工艺解决方案，请联系蓝晓科技：0512-65160522
动物用狂犬疫苗
澄清的病毒溶液浓缩后用Seplife 4FF凝胶过滤层析一步层析纯化，蛋白去除率可达98%以上，抗原回收率可达90%以上。蓝晓科技已为2家客户提供工业生产规模纯化工艺解决方案及层析填料。同时狂犬病毒培养用的Vero细胞用微载体培养，蓝晓科技也提供细胞培养微载体Seplife LX-MC-Dex1。
图8：蓝晓科技微载体在Vero细胞培养中的应用。
更多关于狂犬灭活疫苗纯化工艺解决方案，请联系蓝晓科技：0512-65160522
猪圆环二型亚单位疫苗
Bac-to-Bac系统分泌表达的Cap-VLP，澄清后经一步高回收率离子交换层析纯化，纯度80%以上， 抗原回收率80%以上，蓝晓科技已为6家客户提供了工业化生产规模纯化工艺解决方案及层析填料。
图9：蓝晓科技高回收率离子交换层析纯化PCV2-Cap-VLP色谱曲线及电泳图
纯化结果：昆虫细胞——杆状病毒分泌表达PCV2-Cap-VLP经蓝晓科技SP Large Scale HP一步层析后，纯度>80%，收率>80%
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重组口蹄疫疫苗
大肠杆菌及CHO表达的重组口蹄疫，带his标签蛋白，澄清的蛋白溶液先用金属螯合Ni亲和层析纯化，纯化后通过缓冲液置换组装成VLP.
图10：蓝晓科技Ni填料纯化重组口蹄疫蛋白色谱及电泳图。
纯化结果：大肠杆菌表达口蹄疫亚单位疫苗经蓝晓科技Seplife LXPM-Ni5504IDA一步层析后，纯度>90%，收率>85%。
更多关于重组口蹄疫疫苗纯化工艺解决方案，请联系蓝晓科技：0512-65160522
其它基因工程亚单位疫苗
基因工程亚单位疫苗克隆时可带His-tag,澄清的抗原溶液经Ni亲和层析一步层析后，在用Seplife G 25M或者UF/DF 脱盐及置换缓冲液即可。蓝晓科技已为多个客户提供了多种亚单位疫苗工业生产规模纯化工艺解决方案及纯化填料。
图11：蓝晓科技金属螯合填料在重组蛋白纯化中的应用
经典金属螯合填料
➤Ni Seplife FF(IDA)——载量高，高流速，纯化效率，但不适合含有8M尿素及EDTA,DTT的样品纯化。
➤Ni Seplife 6FF(NTA)——载量高，耐受性，适合含有8M尿素及6M盐酸胍的样品的纯化。
➤Ni Seplife FF(TED)——耐受性好，可以耐受100mM EDTA，非常适合真核外泌蛋白的纯化。可直接使用NaOH在位清洗，无需脱镍挂镍，省时省力。含有8M尿素及6M盐酸胍的样品用此镍填料影响结合，低丰度的样品结合效率效率差。
➤Ni Seplife HP（IDA)——小粒径基质使其有更高的分辨率。
➤IMAC Seplife FF(IDA)——可以自己鳌合不同的金属离子，适合纯化外露His，Cys，Try 残基的蛋白。
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图13：三种络合剂制备的螯合填料结构示意图
His-Tag纯化时金属螯合填料的选择
➤科研微量制备——Ni Seplife HP（IDA)，此填料分辨率高，科研微量制备可用此填料纯化，纯度更高。
➤样品中含有DTT或EDTA——Ni Seplife FF(TED),此填料可以耐受100mM的EDTA及10mM的DTT,样品中含有EDTA及DTT时无需换液直接过镍柱纯化。
➤样品中含有8M尿素（6M盐酸胍）——Ni Seplife FF(NTA),IDA耐受性差，TED结合力弱，在含有高浓度尿素时结合效率差，所以含有变性剂的样品首选IMAC的镍柱。
➤含有Cys/Try残基蛋白——含有Cys/Try 残基的蛋白和镍填料的结合力弱，此时可以选择IMAC Seplife FF(IAD)的填料螯合Cu离子进行亲和纯化（如乌司他丁可用此填料纯化）。
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