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层析填料的孔径及孔隙度
层析填料大多数是具有孔隙度的惰性珠体，即使壳层型填料（如Seplife Suncore 700)其表面涂层也有空隙。填料珠体的孔结构可分为微孔（<10nm）、中孔（10~30nm）、大孔（30~100nm）及超大孔（>100nm）等不同孔径的母体结构，也有报道孔径大于1000nm的合成技术。在分离过程中填料孔的存在有利于分子的传质过程，目标产物分子易于达到介质的活体中心，如蛋白质、酶和多肽等生物大分子，相对分子质量一般在几万至几百万，病毒和质粒的相对分子质量可达几百万至几千万，这些庞大的分子在液体中的扩散系数通常比小分子小1~2个数量级，甚至2~3个数量级，为使这类分子能够接近填料活性中心，必须要有适当的孔径。因此多孔结构的填料在生化分离中获得广泛应用。凝胶过滤层析，对孔的要求更加严格，要求孔分布范围很窄，才能根据目标产物分子的大小进行分离。
层析填料孔径的选择
一般我们可以根据目标物的分子大小、分子尺寸、水化半径等性质来选择不同孔径的填料。这与深层过滤膜选择有些相似。
图1：不同大小分子选择不同孔径的填料
如图1所示，不同分子的大小相差很大，小分子化合物（＜1KDa，氨基酸，单糖等）选择60Å的孔，大一点的多肽分子（＜3KDa，比伐卢定等）选择100到120Å孔，更大的多肽（＞5KDa，胰岛素等）需要选择200Å或以上的孔，更大分子量的蛋白、IgM、病毒、mRNA的纯化可能需要选择100nm(1000Å)甚至更大的孔。
对于生物分子纯化常用的低压软胶填料，分子量<100 KDa优先考虑6FF系列填料（孔径约30 nm），分子量在100-300 KDa，选择4FF系列（孔径约50 nm），分子量>300 KDa推荐选择聚合物系列填料PS/DVB及PMMA填料（孔径大于100nm).
填料孔径及空隙度对层析过程的影响
混合物组分与填料之间相互作用的数量与填料颗粒的表面积成正比。填料的表面积包括颗粒的外表面积和颗粒的内表面积。颗粒内表面积则与填料颗粒的孔径和孔道的连通性相关。填料颗粒的孔径越大，可利用的表面积则越大。一般填料颗粒内表面积要远大于外表面积，只有当填料粒径小于10um时，外表面积才显示出其重要性。
图2：填料孔隙结构示意图
孔隙度是指填料的孔隙体积与填料颗粒体积或者层析柱柱床体积的比值。填料颗粒内孔隙度是指填料颗粒内孔隙体积与填料颗粒总体积的比值。填料颗粒间孔隙度（Interstitial Porosity, εint）是指填料颗粒间的孔隙体积与层析柱柱床体积的比值。
图3：层析填料的空隙度
总柱床体积等于外水体积、内水体积与凝胶体积之和：
Vt=V0+Vi+Vg
填料内孔隙度（Intraparticle Porosity, εp）：填料内孔隙体积与填料总体积的比值。 εp=Vi/Vg
填料颗粒间孔隙度（Interstitial Porosity, εint）：填料颗粒间的孔隙体积与层析柱柱床体积的比值。 εint=V0/Vt
孔隙度（Porosity εtot）:填料的孔隙体积与层析柱柱床体积的比值。 εtot=Vi/Vt
如市售Agarose FF εtot约为0.85（均孔径30nm），PS/DVB εtot约为0.5（均孔径200nm）
参考资料
1. Elwinger F, Wernersson J, Furó, István. SEQ-NMR: A new tool for measuring distribution coefficients and pore size in chromatography media[J]. 2017.
2. Kilz P, Held D. Inverse size-exclusion chromatography for characterization of pore size distributions[J]. LC GC: magazine of liquid and gas chromatography, 2016, 12(2):11
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