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mAb下游之Protein A亲和层析
此过程是对目的抗体分子mAb进行捕获，去除产品相关杂质——聚体、片段，异构体等，和工艺相关杂质——培养基组分、内毒素、HCP,HC-DNA,HC-RNA，可能存在的病毒等。ProteinA对IgG的高亲和特性能一步去除大量杂质，抗体纯度达到95%或更高，收率大于90%。ProteinA亲和层析还是一个有效的抗体浓缩步骤，洗脱液中的抗体浓度可达10g/L以上，大大缩小后续精纯的液体处理。一步Protein A亲和达到浓度和纯化的双重作用。
图1：蓝晓科技rProtein A亲和层析填料
Protein A亲和层析纯化mAb的原理
ProteinA是金黄色葡萄球菌的一种膜蛋白，ProteinA由5个IgG结合域和其他未知功能的非Fc结合域组成，分子量42KD，天然ProteinA对IgG的亲和能力很强，可以吸附大量IgG，ProteinA对抗体重链稳定区Fc有很高的特异性和亲和力，对抗体纯化有很好的通用性，体加载后，先用缓冲液淋洗，去除与介质或抗体弱结合的杂质，然后利用强酸性缓冲液（pH3.0-3.5）洗脱ProteinA上结合的抗体，再利用酸性更强的缓冲液（PH约2.0）去除强结合杂质，进行介质再生。
图2：蓝晓科技rProtein A亲和填料在800*550mm层析柱中进行工作
蓝晓科技重组ProteinA 配基，使用一种自主研发的融合型多聚体蛋白质配基，该配基以天然蛋白 A的五个结构域的多肽序列为基础，利于五种不同结构域进行组合式筛选，得到组成融合型多聚体蛋白质的多肽原始序列，然后基于多肽原始序列通过多位点突变筛选建立了融合型多聚体蛋白质的氨基酸序列文库。利用亲和力测试实验，成功从（8*96）的氨基酸序列文库中成功筛选出 180 条具有适合作为配基的多聚体蛋白序列，然后通过与现有蛋白 A 专利序列的比对分析得到 14 条与现有专利序列不同的多位点突变的融合型多聚体蛋白质序列。此外，我们在融合型多聚体蛋白质的特定序列结构域中键合 linker，以减少蛋白的空间位阻，提升对抗体捕获效率和载量，并将此创新点申请了专利。最终，我们将筛选得到融合型多聚体蛋白质偶联到自主研发的载体上，通过对树脂填料进行系统性色谱性能分析，例如载量，耐碱性，HCP 残留以及其它填料性能，成功获得了具有高碱耐受性和高载量抗体纯化亲和填料。
蓝晓科技自主开发拥有专利的rProtein A系列蛋白A亲和填料于2022年7月14日通过美国FDA DMF备案（MF#：037326），成为国内为数不多的通过FDA DMF备案的国产填料供应商。这意味着使用蓝晓科技相关产品的客户，在向FDA提交进行新药注册的监管备案文件中可直接引用DMF备案资料，而无需再提供有关原料和辅料的具体信息。
具有以下特点
✔自主研发，品质保证，专利保证
✔高载量：5min保留时间载量80mg/ml
✔耐碱性好：耐受0.5M NaOH
✔完整的支持文件：RSF、DMF、MSDS、TSE/BSE
✔低配基脱落：小于 2 ppm
✔货期短，1-2周可以交
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mAb纯化中Protein A配体脱落的原因
Protein A在使用过程中会发生脱落，脱落的主要原因是细胞培养液上清中含有蛋白水解酶，在上样过程中会对Protein A进行水解。部分脱落的Protein A与抗体结合，残留在洗脱液中。蓝晓科技通过自主开发，重组Protein A分子的特殊设计稳定的键合技术制备的亲和填料，配体脱落率极低。
mAb纯化中Protein A层析过程质量控制
Protein A在使用过程中对上样载量、上样pH、洗脱pH、收集AU，保留时间，进行控制。检测mAb分子浓度、HPLC-SEC、CEX、糖型、HCP、H-DNA、HC-RNA、毛细管电泳（Capillary Electrophoresis，CE，中国药典2015版的第三部中增加了 CE技术，明确了CE是单克隆抗体药物大小变异体、电荷变异体、鉴别与一致性和糖基化修饰分析中的重要方法。）、内毒素、Protein A脱落量，其检测项可根据每个企业的要求不同而有所变化。
图3：蓝晓Protein A层析填料用于mAb纯化中质量检测
（1-6-Cycle)
图4：蓝晓Protein A层析填料用于mAb纯化中质量检测
（72-120-Cycle)
图5：蓝晓科技rProtein A Seplife Suno 亲和层析填料纯化mAb CE-SDS检测数据（1-60Cycle）
图6：蓝晓科技rProtein A Seplife Suno 亲和层析填料纯化mAb CE-SDS检测数据（72-120 Cycle）
CE-SDS用于分析剪切变异体；蛋白的纯度测定药典金标准，已经从SDS-PAGE转变为十二烷基硫酸钠-毛细管凝胶电泳（CE-SDS）方法，用于分析还原和非还原的变性蛋白，常用于单抗；蛋白质的等电点测定，毛细管等电聚焦(CIEF)比传统胶条方法更为准确；糖蛋白药物的糖基异质性表征，毛细管电泳是高分辨率分析方法之一。
表1：抗体药物的表征分析方法
高效液相色谱法（HPLC）可对抗体药物以及重组蛋白药物中的不均一结构带来的异质性进行有效的分析。离子交换色谱法可用于分析电荷变异体；亲水色谱法则可用于分析寡糖分布；这二者和疏水色谱法、反向高效液相色谱法均可对抗体中的带电异构体、结构异构体，或者由于糖基化、脱酰胺化和氧化等作用引起的杂质进行高分辨率分析；尺寸排阻色谱法（SEC）则利用了分子空间结构的不同，可对抗体多聚体、片段、PEG化蛋白等样品进行有效分析。
高分辨率的MALDI-TOF或者ESI-MS可对完整抗体药物进行分子量的检测，还可对脱糖前的抗体药物进行分析，以得到糖基化类型的信息及糖基化水平的分布。质谱分析仪检测蛋白和肽片段的分子量偏差，可以实现高灵敏、高通量和高精确地鉴别蛋白质的翻译后修饰的种类。在抗体药物质量分析中，质谱与液相色谱联用等方法也较为常见。
液相色谱-质谱联用(LC-MS）技术是获得抗体药物生物分析数据的主流方法，然而 虽然已经开发了低流速LC-MS(如nano LC-MS)和免疫亲和(IA)-LC/MS来提高灵敏度, 但代价是降低了重现性和分析通量。随着质谱分辨率、质量精度等检测性能的提升以及半自动化数据处理软件的开发,目前出现了基于质谱的多属性分析方法(multi-attribute method,MAM)。该方法通过质谱分析治疗类抗体药物的肽段,可以对包括糖基化、氧化、脱酰胺、异构化、C末端赖氨酸缺失在内的诸多PQA进行定量分析, 反映PQA在变异体、多批次稳定性样品、工艺开发与变更样品中的变化。MAM还具有杂质分析功能,为药品的质控提供更加快速和全面的分析,属于开发中的下一代新型迭代验证方法。
mAb纯化中Protein A亲和层析工艺表征
采用缩小模型（Scale-down）对Protein A亲和层析的工艺参数范围进行研究，以确定影响Protein A亲和层析的工艺参数和关键质量属性的关系，从而指导生产规模的设计空间和操作空间。
图7：多种研究表表明在Scale-down模型中研究的ProteinA亲和层析过程采用DOE实验表征的因素
缩小模型的设计基于完善的层析比例缩放原则，保持相同的柱高、线性流速、上样载量、清洗和洗脱体积和基于塔板数和对称性的柱效。模型的确认一般需要使用实验室规模系统的三次重复运行，并对实验室，中试和生产规模的性能参数值的平均值做统计比较，包括产品收率、峰面积、杂质去除（例如HCP，DNA和内毒素）、以及Protein A残留的水平等。当不同规模之间的柱效或性能参数没有统计学上的显著差异时，缩小模型可以准确代表完整商业化生产规模系统，适用于工艺表征研究。
图8：多种研究表表明在Scale-down模型中研究的ProteinA亲和层析过程的结果验证及影响因素
风险评估方法根据工艺变量对CQAs的潜在影响、工艺性能以及可能与其他参数的相互作用，使用风险排序对工艺变量进行分类。每个参数被分配两个等级:一个基于对CQAs(主效应)的潜在影响，另一个基于与其他参数潜在的相互作用；对于风险评分值较高且无交互作用的参数，可采用单变量试验进行研究，对于风险评分值较高且有交互作用的参数，可采用DOE进行研究,同时也包含Protein A亲和填料清洗工艺开发及使用寿命验证等相关工作。
参考资料
1.Roman A. Zubarev and Alexander Makarov.Orbitrap Mass Spectrometry. doi.org/10.1021/ac4001223 Zhongqi Zhang, Hai Pan, and Xiaoyu Chen. Mass spectrometry for structural characterization of therapeutic antibodies. DOI 10.1002/mas.20190
2.Howard L. Levine, Brendan R. Cooney The development of therapeutic monoclonal antibody products, a comprehensive guide to CMC activities from clone to clinic.
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