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重组人源化胶原蛋白生产工艺
用DNA重组技术，将人源胶原蛋白基因克隆，并转化进大肠杆菌或者酵母菌中，通过发酵表达的方式生产重组人源化胶原蛋白原液，原液热处理（通常60-65℃水浴，10-30min）灭活发酵中产生的蛋白酶，原液热处理后在根据用途用盐析或者层析的方法进行纯化，并用10-30KD的UF/DF TFF膜组件进行浓缩，置换缓冲液，脱盐等，最后经0.22um微滤膜组件进行除菌过滤制备而成。
图3：酵母分泌表达的重组胶原蛋白纯化工艺
国家“十四五”重点布局领域再生材料——丝素蛋白
图4：蚕丝（来源：搜狗百科）
国家发改委等部门印发的《“十三五”国家战略性新兴产业发展规划》中，细胞组织诱导性生物材料被列入《战略性新兴产业重点产品和服务指导目录》中；“十四五”重点研发计划中，天然生物材料如壳聚糖、丝素蛋白、细胞基质等也被纳入“诊疗装备与生物医用材料”重点专项，再生医学更是国家重点布局和规划的前沿方向，其中丝素蛋白作为一种优秀的再生生物材料具有巨大的市场前景，本文将从优势特性、临床应用、政策法规等方向带大家了解丝素蛋白。
来源：科技部国家重点研发计划重点专项
丝素蛋白，是从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白，蚕丝主要由丝胶（silk sericin）和丝素纤维（silk fibroin fiber）形成的若干管状结构组成（见下图）构成丝素纤维的丝素蛋白被认为是蚕丝机械性能的主要来源，主要由于丝素蛋白分子间可形成较规则的β-折叠晶体结构；丝胶蛋白是一种胶状的无定形蛋白，以涂层形式存在，主要起黏贴作用，可以作为粘合剂来保持纤维的结构完整性。
重组丝素蛋白
近日，华东理工团队在 Int. J. Biol. Macromol. 上发表了题为“An engineered Pichia pastoris platform for the biosynthesis of silk-based nanomaterials with therapeutic potential”的论文，首次报道了在工程毕赤酵母中高水平分泌生产重组 SF 肽及其加工成纳米材料。研究人员优化后的毕赤酵母底盘 PPGSP-8，通过补料分批发酵，生产重组 SF 肽 BmSPR3 和 BmSPR4 的滴度分别为 11.39 和 9.48 g/L。由重组 SF 组装的纳米颗粒 R3NP 和 R4NP， 与源自市售 SF 的 RSFNP（再生丝素蛋白纳米颗粒）相比，其物理化学性质相似甚至更优。
（来源：Int. J. Biol. Macromol.）
该研究以毕赤酵母 GS115 为宿主菌株，该类菌株已在多个行业中用于生产异源蛋白质。目标蛋白质是 BmSPR3 和 BmSPR4，即天然 SF 的疏水结晶域。
研究人员将编码两种天然 SF 肽的基因，即家蚕 SF 重链的第三 (R3, 376 aa) 和第四 (R4,164 aa) 疏水结构域，在毕赤酵母 GS115 中合成和表达 。然后将来自酿酒酵母的 α 因子分泌信号 (Sα)与重组 SF 肽的 N 端融合。Sα 是一种用于促进异源蛋白分泌的信号肽。由于重组 SF 蛋白的溶解性较差（由单个疏水结构域的表达引起），根据 SF 蛋白重链疏水结构域之间的亲水序列，设计人工亲水结构域（3×Flag）与氨基酸序列的 N 末端和 C 末端融合。
研究人员通过改造 P.pastoris 菌体，增强其蛋白质合成和分泌功能，以表达重组 SF，从而建立了一个用于生物合成丝基纳米材料的 P.pastoris 平台。由此产生的两个细胞工厂可以高产量合成 BmSPR3 和 BmSPR4。此外，通过在培养基中添加 Tween 80 来抑制发酵过程中蛋白质聚合物的自组装，分泌的重组 SF 肽自组装成纳米纤维和 NPs。
重组蛋白纯化填料：
His融合蛋白纯化——Ni Seplife FF(NTA).
去除内毒素——Q Seplife FF
异构体去除——MA/MMC Large Scale
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监管部门定制行业标准
随着丝素蛋白医疗器械产品的增加，对这一材料的生产制备、质量控制等提出了要求。相对于产业的迅速发展，丝素蛋白相关标准在国际国内仍处于空白。由于标准的缺乏，各丝素蛋白企业在企业标准制定过程中无统一的标准参考依据，限制了丝素蛋白医疗产业的高质量发展。目前，为提高丝素蛋白材料的质量与安全性，为科学监管提供支撑，由全国外科植入物和矫形器械标准化技术委员会组织工程医疗器械产品分技术委员会归口的《组织工程医疗器械丝素蛋白》已形成征求意见稿，并于2022年8月23日-2022年10月24日期间公开征求意见。
征求意见稿中提到，“从组织工程材料的发展趋势看来，具备良好的生物相容性及体内可吸收性的天然生物材料将受到青睐。天然生物材料在结构、力学、和生物降解性能可控的情况下，在临床应用中具备巨大潜力。其中来源于天然桑蚕丝的丝素蛋白不仅具有良好的生物相容性，同时还具有较高的力学强度与较慢的降解速率，植入体内免疫原性低，原料来源广泛，易于加工制造，可被制成多种形态的支架用于不同组织的修复，现已受到越来越多的重视，不断有研究将其用于组织再生并进行产品开发。丝素蛋白作为一种优秀的生物医用材料具有巨大的市场前景。”
丝素蛋白的结构
丝素纤维由蚕茧脱胶而得,约占蚕丝蛋白总量70%。丝素纤维被溶解后,丝素蛋白的氨基酸组成和序列不会改变。丝素蛋白的重链基因编码5 263个氨基酸残基,其中包括甘氨酸(45.9%)、丙氨酸(30.3%)、丝氨酸(12.1%)、酪氨酸(5.3%)、缬氨酸(1.8%)及15种其他氨基酸(4.7%)。重链的氨基酸序列可分为N端头部和C端尾部,相间排列的12个疏水的重复序列和11个亲水的非重复序列,如图2所示。
图2：丝素蛋白一级结构
（来 源：《丝绸》2024年 第61卷4期 ）
丝素蛋白重链的氨基酸序列为形成规整的二级结构和聚集态结构奠定基础。丝素蛋白二级结构的构象主要有四种:无规卷曲、α螺旋、β折叠和β转角。重复序列中,甘氨酸与某些氨基酸逐个交替连接成六肽,通过分子间或分子内的相互作用力形成反平行β折叠。其中,丙氨酸在β折叠的一侧形成疏水面。丝氨酸的存在可使相邻β折叠间的结合更紧密,增加结晶区的硬度和强度。重复序列中的甘氨酸-丙氨酸-丙氨酸-丝氨酸四肽形成β转角,打断结晶性。亲水的非重复序列中含有带电荷基团或带大侧链基团的氨基酸残基,不能形成β折叠,但其中的脯氨酸可形成环状结构,促进反平行β折叠形成。
丝素蛋白的聚集态结构主要分为Silk I和Silk II。Silk I中包括α螺旋及其他非β折叠结构,不稳定且易溶于水。在固态核磁共振法研究中,Silk I被认为是II型β转角结构。β转角中央的两个氨基酸残基能与水形成氢键,因此Silk I的亲水性好。Silk II主要为反平行β折叠结构,反平行β折叠能量上处于最低状态,稳定且不溶于水。
Qiu等提出的丝蛋白材料五级介观多级结构认为丝素蛋白各级形成关系为:在重复序列中每6个氨基酸为一个β股(一级结构);β股间以氢键相互作用维持稳定的β折叠(二级结构);β折叠间以疏水相互作用和范德华力连接,形成β微晶(三级结构);β微晶通过无定形链连接形成纳米微纤(四级结构);纳米微纤间相互作用缠结形成纳米微纤网络(五级结构),如图3所示。
图5：丝素蛋白材料五级介观多级结构
（来 源：《丝绸》2024年 第61卷4期 ）
纳米微纤实际上由交叉-β构象构成,是广义上的Silk II。通常认为丝素蛋白材料的强度和刚度由Silk II决定,而延展性和柔韧性由Silk I控制。在纳米微纤中,β微晶作为物理交联点在拉伸过程中承担主要拉力,而无定形链的存在又赋予其柔性。这种无定形链连接β微晶节点形成的拓朴网络结构,使得纳米微纤拥有比自然界其他物质更柔韧、坚固的力学性能。
丝素蛋白的特点
1.生物相容性：作为天然高分子蛋白材料，丝素蛋白可被机体降解吸收，具有很好的生物相容性。来自临床前体内研究和人类在各种应用中的临床经验的最新证据表明，高纯度的蚕丝素蛋白具有良好的生物相容性
2.生物可降解性：丝素蛋白材料可在体内完全降解，且降解时间可一方面通过调节Silk I和Silk II的比例控制，另外也可以通过制备工艺调节
3.机械性能：天然蚕丝纤维的初始模量为5-12Gpa，断裂强度为500Mpa，断裂拉伸长率为19%，与天然丝素纤维相比，再生丝素材料力学性能会有所下降；可通过将一些高分子物质，如聚乙二醇、聚己内酯、聚乙烯醇等，与丝素蛋白进行共混，可以达到改善丝素材料力学性能的效果；另外，向丝素蛋白材料中添加微／纳米级别的物质，同样可以制备得到力学性能增强的丝素蛋白材料。
丝素蛋白的应用
1.医美注射填充剂：数据显示，2023年轻医美市场规模已达到770元，2016-2023年4年复合增速为25.54%。随着轻医美市场逐步扩张，价格低、恢复快、风险低的注射类项目有望持续放量。伴随着少女针和童颜针等再生注射产品的获批，注射医美市场未来将由“填充时代”迈入“再生时代”，再生针剂是我国医美注射针剂市场新增长点。丝蛋白作为天然的“再生类”填充产品，具有更为安全和高效的优势，可达到即时填充和刺激胶原蛋白再生的效果，达到长期组织替代作用，已有少数企业布局。
2.脑机接口柔性电极：丝素蛋白材料可在体内完全降解，且降解时间可一方面通过调节Silk I和Silk II的比例控制，另外也可以通过制备工艺调节
3.药物传递载体：基于丝素蛋白的微球因对多种药物的高亲和力，受控的靶向缓释特性和温和的制备条件而被广泛应用于药物传递系统，通过将丝素蛋白与具有特定功能的无机或有机物质相结合所形成的丝素复合微球，可用于传输小分子药物(如抗癌药物),蛋白质和生长因子药物，抗菌药物等。
4.创面敷料：仿生生物敷料作为诱导皮肤再生的潜在替代物备受关注丝素蛋白成膜性良好，丝素蛋白可被设计构建成支架、水凝胶、纳米纤维薄膜和微针等不同材料，且这些材料已被成功用于创面治疗[4]。大量研究证实丝素蛋白创面修复材料因具备同天然皮肤ECM相似的纳米纤维结构和诱导胶原蛋白合成的能力，从而表现出主动诱导创面愈合的性能。
5.骨修复材料：修复再生材料与人体骨组织成分和结构相近，植入人体之后，人体骨组织会在材料材料的多孔结构内部生长，与其形成骨性结合及血管化、神经化结构等。随着植入材料的逐渐降解以及新骨骨量的不断增加，完成骨组织的修复再生。
6.手术缝合线：蚕丝被用作手术缝合线制作已有几百年历史，在临床有广泛应用，具有更好的强度和韧性，一般用于皮肤闭合、胃肠道手术、心血管手术、整形手术、眼科和神经系统手术中。
参考资料：
[1]赵瑞波,谢番,罗丹丹,等.丝素蛋白再生医学材料对细胞功能调控的研究进展[J].丝绸, 2022, 59(1):10.
[2]An engineered Pichia pastoris platform for the biosynthesis of silk-based nanomaterials with therapeutic potential
[3]王苗苗、孙雪、韩倩倩. "丝素蛋白在组织修复领域的应用进展." 中国药事 34.8(2020):4.
[4]王苗苗, 韩倩倩. 丝素蛋白的制备方法及在生物医用材料领域的应用[J]. 中国医疗器械杂志, 2021.
[5]丁召召, 吕强. 丝素蛋白生物材料在创面修复中的应用研究进展[J]. 中华烧伤与创面修复杂志, 2022, 38(10): 973-977.
[6]《组织工程医疗器械丝素蛋白》征求意见稿.国家药品监督管理局医疗器械标准管理中心
*《“十三五”战略性新兴产业发展规划》
*《战略性新兴产业重点产品和服务指导目录》
*《“十三五”生物产业发展规划》
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