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小核酸药物发展概论
1998年Andrew Fire 和 Craig Mello 在线虫中首次揭示了RNA干扰的作用机理（ RNA interference，RNAi ），两人因此于 2006 年获得诺贝尔奖。小核酸药物作为诺贝尔奖级理论的临床实践，可堪称为人类疾病治疗领域的革命性技术进步，也逐渐成为生物制药领域的必争之地。近年来小核酸药物递送系统如LNP及Galnac技术的成功应用给小核酸药物的发展带来了“加速度”。
狭义上小核酸是指小干扰RNA(siRNA)，广义上包括小干扰RNA(siRNA)、反义寡合苷酸(ASOs)、信使RNA(mRNA)、核酸适配体(Aptamer)等。
寡核苷酸治疗起源于1978年报道的一项研究，Zamecnik 和 Stephenson 首次报道了 13 聚体合成单链 ASOs可通过靶向劳斯肉瘤病毒 mRNA 导致翻译停滞，并表明它可以在组织培养中抑制病毒复制。1998年，第一个ASOs药物Fomivirsen批准上市，主要用于治疗艾滋病并发的巨细胞病毒(CMV)性视网膜炎。而后十年，因受限于稳定性、药物递送、作用机制等核心技术问题，ASOs药物经历了发展低谷期。2016年，有两款ASOs药物获批上市，标志着ASOs药物在关键技术上取得了突破性进展。截止2022年，处于临床阶段的寡核苷酸药物已超过100款，已经获批上市的13款，其中有8款为反义核苷酸药物。
小核酸药物的纯化
小核酸药物分子和杂质分子之间的差异
磷酸基团（Phosphate group）：
寡核苷酸所带静电荷取决于磷酸或修饰基团的数目，碱基的数目以及二级结构是否遮蔽带电基团；通常在变性条件（例pH12）打开氢键使结构展开以有效区分N-1杂质。
DMT on/off：
DMT是一个强疏水性基团，与反相层析/疏水层析产生相互作用。因此可以用于带有DMT的全长序列的分离
硫代（Thiolation）：
当磷酸基团中的氧原子被硫原子取代时，带负电的基团极性增加，在大多数pH条件下与阴离子交换填料结合更强。推荐阴离子交换填料Seplife LXMS 15Q。
甲基化（Methylation）：
当氧原子被甲基取代时，疏水增强。
根据小核酸药物分子和杂质分子之间的差异，疏水反向层析和离子交换层析广泛用于小核酸药物的分离纯化。推荐填料反相填料Seplife RP LXMS 15/30。
图1：小核酸药物的层析纯化
纯化案例1：
用蓝晓科技单分散聚合物反向层析填料Seplife RP LXMS 30纯化20mer，一步纯化纯度达到98%以上，如图2，纯化色谱图。
图2：20mer核酸用Seplife RP LXMS 30纯化色谱图
纯化案例2：
用蓝晓科技单分散聚合物离子交换填料Seplife LXMS 15Q纯化21mer，一步纯化纯度达到99%以上，如图3，纯化色谱图。
图3：21mer核酸用Seplife LXMS 15Q纯化色谱图
小核酸药物纯化填料推荐
离子交换层析填料
Seplife LXMS 15Q/30Q:以单分散聚苯乙烯微球为基质，通过蓝晓科技独特的亲水改造和表面键合技术，键合离子交换配体，使填料具有更大的分离度和更高的动态载量，聚合物材质使其可以耐受3Mpa的压力，稳定的机械强度。
反向层析填料
Seplife RP LXMS 30/15/10：单分散聚合物反向层析填料是直接聚合的高效层析填料，单分散微球，使填料装柱后，柱床更稳定，同时聚合物材质使其高化学稳定性，可以用1M的NaOH及1M HCl进行CIP。
疏水层析填料
Seplife LXPM Butyl5504S :以聚甲基丙烯酸酯微球经过适当的亲水改造，键合疏水配体，化学稳定性好，机械强度高，广泛用于小核酸药物的分离纯化。
更多关于小核酸药物的纯化填料的信息，请联系蓝晓科技：
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参考资料
1. Dhuri K, Bechtold C, Quijano E, et al. Bahal R. Antisense Oligonucleotides: An Emerging Area in Drug Discovery and Development. J Clin Med. 2020 Jun.
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