层析柱柱效测定方法及异常解析

文摘   2024-10-17 14:40   江苏  

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柱效

1952年,马丁(Martin)和欣革(Synge)最早提出塔板理论(Plate theory),把一根连续的层析柱设想成由许多小段组成,在每一小段内,假定样本可以在固定相和流动相中达到分配平衡,这样一个小段称为理论塔板,一个理论塔板的长度称为理论塔板高度。主要反映柱子的分离效果。理论塔板高度(HETP)计算公式:HETP=L/N。

其中 L = 柱高(cm)

N = 理论塔板数

Ve= 洗脱峰体积

W1/2 = 半峰高处宽度

Ve和 W1/2单位相同

VR=保留时间  

Wh=半峰高时的峰宽

L=柱高  

HETP=理论塔板高度

h=实际塔板高度(一个塔板高度堆积填料的个数)

dp=填料颗粒平均直径

As=峰对称因子(对称性,也称峰不对称因子 (Asymmetry, AS),用来评价层析柱装填的均匀程度。)

对称性计算公式:AS=b/a

b:10%峰高位置的后一半峰宽

a:10%峰高位置的前一半峰宽


评价标准:一般情况下,理论塔板高度HETP<4倍粒径大小即为比较理想的柱效,实际塔板高度h≤3,理论塔板高度HETP>1000000/dp/3,对称因子AS 0.8-1.8之间。

✪实际使用过程中,通常用理论塔板数N和对称因子两个参数评价即可。


层析柱柱效测定方法

方法一(适用于凝胶过滤和离子交换)

样品:2%丙酮溶解在水溶液中

溶液:纯化水

上样量:1% CV

流速:20-40cm/h


方法二(适用于反相和疏水层析)

样品:2%丙酮溶解在20%乙醇中

溶液:20%乙醇

上样量:1% CV

流速:20-40cm/h


方法三(通用)

样品:0.8M NaCl  

溶液:0.4M NaCl

上样量:1% CV

流速:20-40cm/h

★合成聚合物填料推荐流速:60cm/h


装柱时色谱峰分析

标准峰:符合正态分布可正常计算柱效,大多数峰均可计算柱效查看装柱状态是否良好,但双峰或者多峰就无计算的必要,需查找原因重新测定或者重新装柱。


骆驼峰:当前样品出现两次峰型,主要原因一般为填料在层析柱内部断层,不均一,一般是由于装柱时进气,或者二次压柱导致填料出现断层。另一原因主要为填料过脏(主要为上层)或者柱头有堵塞的情况。出现以上情况都需处理后,重新装柱


拖尾峰与前倾峰:当Af>1时,我们称作拖尾,拖尾为柱床压的过松,当Af<1时我们称作前倾,前倾为柱床压的过紧。通常在0.9-1.3的范围内我们认为良好对称性,对于部分要去不高的甚至卡到0.8-1.5,就可满足生产(因有时为第一步粗纯,较好的对称性的柱效有时效果不明显(主要还是考虑到实际生产的便捷性),但总体上的效果还是柱效越高,对称性越接近于1,效果越好。


矮胖峰:通常的主要原因为样品进入柱子时被稀释,选择柱子进口上样,如还存在问题,需重新装柱,再次测量柱效。


毛刺峰:通常的主要原因为有细小气泡伴随样品出现,排气泡后再次测量,如效果不达标,需重新装柱,装柱过程中注意提前排气泡,对填料进行更好的匀浆,将填料内部气泡尽量排出。


漂移峰:通常的主要原因为为平衡好,基线不稳,重新平衡,平衡稳定后,再次测量柱效,结果不合格时重新装柱。


阶梯峰:通常的主要原因为有残留死体积大导致,可能是由于密封圈使用错误导致,检查密封圈使用的是否正确,并检查是否有加大死体积部位,后重新测量,如结果不合格需重新装柱。



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