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亲和层析主要依靠蛋白质与介质配体间特异性的可逆结合作用进行分离。配体可直接与目标蛋白质结合，也可以与蛋白质共价结合的标签结合。亲和层析通常在纯化工艺的前期应用，可将目标物质快速的从样本中捕获出来，基于后续应用的要求，可能只需要一步亲和层析即可获得纯度合格的蛋白质。
蛋白质和亲和介质不结合
标签未翻译或标签被包裹在结构内部
检查质粒序列或将标签移到其他位置，标签移到其它位置扔被包裹在结构内部时，就要将标签暴露出来（如用尿素变性，但尿素变性性只有部分标签蛋白可以和亲和填料结合如His标签蛋白和金属螯合填料，但GST标签和GST填料就不能在亲和结合）
结合缓冲液不合适及层析柱没平衡好
调整缓冲液，如金属螯合介质和His标签蛋白结合时pH应在7.3-8.5之间，在如肝素亲和介质和DNA聚合酶结合时盐浓度太高影响结合，应控制在50mM以下。层析柱没平衡好，柱床体系中的环境如pH，离子强度也会影响结合，层析上样前要充分的平衡层析柱。
结合时间不够
降低上样流速让蛋白和介质有充分的接触时间。
层析介质选的不合适
亲和介质分类，一类是特异性结合一种蛋白，另一类是特异性结合一类蛋白。如蛋白a介质结合一种蛋白，而肝素介质结合一类蛋白。所以选择的时侯我们一定要了解其原理。
重组蛋白A可特异性与抗体的Fc区结合，用于单抗或多抗的分离纯化，经过一步层析，就可从腹水，血清或培养液等样品中得到高纯度的抗体。
图2：蓝晓科技Protein A亲和层析纯化mAb案例
重组蛋白G可用于分离纯化细胞培养液或细胞提取物中不同属抗体或抗体的Fc片段，多位点活化偶联减少了配体的泄露，用于IgG单克隆抗体的实验室规模和工业化大规模纯化，能迅速处理大体积样品
蓝晓rProtein A填料具有以下特点
✔自主研发，品质保证，专利保证
✔高载量：5min保留时间载量80mg/ml
✔耐碱性好：耐受0.5M NaOH
✔完整的支持文件：RSF、DMF、MSDS、TSE/BSE
✔低配基脱落：小于 2 ppm
✔货期短，1-2周可以交
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亲和层析介质的分类
苏州蓝晓生物都有那些亲和介质
金属螯合亲和层析介质
➤Ni Seplife FF(IDA/NTA/TED)
GST标签蛋白纯化亲和介质
➤Glutathione Seplife 4FF
抗体纯化亲和介质
➤rProtein A Seplife Suni
➤rProtein A Seplife Suno
➤rProtein G Seplife 4FF
质粒DNA亲和层析介质
➤Plasmid Seplife LX
丝氨酸蛋白酶亲和层析介质
➤Benzamidine Seplife 4FF
肝素亲和层析介质
➤Heparin Seplife CL-6B
➤Heparin Seplife FF
硼酸亲和层析介质
➤Boricacid Seplife 4FF
蓝色染料亲和层析介质
➤Blue Seplife FF
➤Red Seplife FF
预活化介质
➤Epoxy Activated Seplife 4FF
➤CNBr Activated Aeplife 4FF
更多亲和介质信息请联系苏州蓝晓生物
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经典金属螯合填料
➤Ni Seplife FF(IDA)——载量高，高流速，纯化效率，但不适合含有8M尿素及EDTA,DTT的样品纯化。
➤Ni Seplife 6FF(NTA)——载量高，耐受性，适合含有8M尿素及6M盐酸胍的样品的纯化。
➤Ni Seplife FF(TED)——耐受性好，可以耐受100mM EDTA，非常适合真核外泌蛋白的纯化。可直接使用NaOH在位清洗，无需脱镍挂镍，省时省力。含有8M尿素及6M盐酸胍的样品用此镍填料影响结合，低丰度的样品结合效率效率差。
➤Ni Seplife HP（IDA)——小粒径基质使其有更高的分辨率。
➤IMAC Seplife FF(IDA)——可以自己鳌合不同的金属离子，适合纯化外露His，Cys，Try 残基的蛋白。
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图5：三种络合剂制备的螯合填料结构示意图
His-Tag纯化时金属螯合填料的选择
➤科研微量制备——Ni Seplife HP（IDA)，此填料分辨率高，科研微量制备可用此填料纯化，纯度更高。
➤样品中含有DTT或EDTA——Ni Seplife FF(TED),此填料可以耐受100mM的EDTA及10mM的DTT,样品中含有EDTA及DTT时无需换液直接过镍柱纯化。
➤样品中含有8M尿素（6M盐酸胍）——Ni Seplife FF(NTA),IDA耐受性差，TED结合力弱，在含有高浓度尿素时结合效率差，所以含有变性剂的样品首选IMAC的镍柱。
➤含有Cys/Try残基蛋白——含有Cys/Try 残基的蛋白和镍填料的结合力弱，此时可以选择IMAC Seplife FF(IAD)的填料螯合Cu离子进行亲和纯化（如乌司他丁可用此填料纯化）。
蛋白质结合在亲和柱床中未洗脱出
蛋白和介质结合力过强
增加洗脱强度，比如his蛋白和镍柱结合，可以增加取代基咪唑的浓度。
蛋白聚集在层析柱上
通过调整层析过程的缓冲液增加蛋白的稳定性，改善蛋白在层析柱上的状态。聚集在层析柱上时就要对层析柱进行CIP清洗。
蛋白经亲和层析后低分辨率（洗脱后纯度低）
层析过程流速的影响
调整层析过程的流速，流速影响蛋白质和介质的亲和力，层析时要选择合适的流速。
柱床未充分淋洗
上样后，要对柱床进行充分的淋洗，将未和介质结合的留在介质颗粒间隙，孔内的蛋白洗出来，在洗脱。
蛋白之间的非特性结合
优化体系缓冲液，比如加入10%的甘油等减少蛋白之间的非特异性结合。
介质的非特异性结合
优化缓冲液，减少层析过程的非特异性结合，如His蛋白用金属螯合填料纯化时，可以在缓冲液中加入300mM的氯化钠，减少蛋白和介质的非特异性结合。
洗脱过程的影响
如肝素柱子洗脱过程中拉合适的盐梯度可以提高特异性，His标签蛋白和金属螯合介质结合后，洗脱时拉咪唑梯度可以提高纯度。
蛋白质纯化过程中失活
蛋白去折叠或聚集
优化缓冲液使其利于蛋白质保持稳定。蛋白质在介质上的高密度下容易聚集可以添加一些蛋白的增溶剂等。
纯化过程中保持蛋白的活性的辅助因子被去除
如一些酶类的活性需要金属离子辅助其活性，在纯化过程中就要添加蛋白的活性辅助因子。
更多蛋白质亲和层析纯化问题请联系苏州蓝晓生物0512-65160522
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