西安蓝晓科技新材料股份有限公司
苏州蓝晓生物科技有限公司
联系电话：0512-65160522
概论
在生物制药、结构研究、体外生物化学分析等很多应用中都需要进行蛋白质等生物分子纯化。蛋白质可以从组织中获取，亦或更经常的是从模式生物中过量表达获得，如细菌、酵母或哺乳动物细胞培养等。蛋白质纯化主要是根据它们理化性质的差异来从原料种进行分离纯化，其目的就是获得最多且高纯度的功能蛋白质。一个好的蛋白质的纯化过程必须要将其纯化工艺步骤优化至最少。
建立蛋白质纯化工艺时，最重要的是需要考虑纯化得到的蛋白质应能满足其后续应用要求。蛋白质的含量及纯度都必须满足应用要求。而且，因为后续应用需要的是保持良好折叠结构的活性蛋白质，因此蛋白质活性的相关信息也需要考虑。在纯化及后续的保存过程中，很多处理方法都会对蛋白质的性质产生影响，如蛋白质的去折叠、聚集、降解和失活等。制定详细计划，在最短时间内完成蛋白质纯化，并在最稳定的条件下进行保存才算是成功地完成了其整个纯化过程。
主办方：苏州蓝晓生物科技有限公司
直播时间：2024年7月16日19:30开始
授课老师：郑鹏涛
报名方式：微信扫描下方二维码报名
直播内容:
➤重组蛋白纯化工艺的开发原则及策略
➤重组蛋白纯化前样品的预处理方法
➤重组蛋白纯化工艺建立的影响因素
➤重组蛋白纯化工艺的建立
➤重组蛋白纯化工艺的工业放大
缓冲液的确定
每一步纯化过程中，蛋白质的溶液环境对其稳定性和活性的保持都非常关键。蛋白质应该保存在一个良好的缓冲液环境中，要避免突然的pH值变化，以其防止对蛋白质折叠状态、溶解性和活性造成不可逆的影响。
缓冲液是一种含有共轭酸/碱对的水溶液。缓冲液的pH值范围根据其pKa值决定。该pKa值定义为50%的分子为酸式结构，50%为碱式结构时的pH值 （图1）。
图 1. 含Tris碱及其酸式物的Tris缓冲液溶液。Tris 25°C的pKa值是8.06，表示当pH=8.06，50%的Tris是质子化（酸式结构），50%是去质子化（碱式结构）。
关于缓冲液的一个常规原则是，其pH值应保证在pKa值左右1个pH值单位范围内，从而保证其具有良好的缓冲能力。如此可以保证同时有足够的以酸式结构和碱式结构存在的分子在加入 H+ 或者 OH- 时可以将它们中和。这样，缓冲液就可以防止pH变化导致的蛋白质稳定性改变。
一种好的缓冲液应具备以下特征：
很多物质都可以用于生物缓冲液。最常使用的缓冲液成分通常具有接近中性的pKa值，可在生理pH值范围左右使用。表1列出了4种最常用的生物缓冲液、各自的pH值应用范围及各自可能对蛋白质纯化过程产生影响的优缺点。为保证足够的缓冲能力，这些缓冲液的浓度通常为20mM。
| 缓冲液 | pH范围 | 优缺点 |
|---|---|---|
| 磷酸缓冲液 | 5.8-8.0 |
|
| MOPS缓冲液 | 6.5-7.9 |
|
| HEPES缓冲液 | 6.8-8.2 |
|
| Tris缓冲液 | 7.5-9.0 |
|
表一：蛋白质纯化中最常用的生物缓冲液。缓冲液在一定pH值范围内可保持它们的缓冲能力，部分缓冲液成分会对某些层析过程或者分析实验造成影响。
溶液添加剂
除了一个合适的缓冲液体系，蛋白质纯化过程中——从溶菌到保存——所使用的溶液通常还含有很多其他对蛋白质纯度、稳定性和活性方面均具有一定作用的成分。
溶菌缓冲液和纯化工艺的前期步骤中常常会添加蛋白酶抑制剂以防止目标蛋白质被内源性蛋白酶酶解。而纯化工艺的后期一般不用再添加这些蛋白酶抑制剂，因为此时几乎所有的蛋白酶都已经从目标蛋白质分离出去。蛋白质的保存缓冲液中通常要添加金属螯合剂，如EDTA或EGTA。这些金属螯合剂与 Mg2+结合以防止目标蛋白质被所含的金属蛋白酶分解。还有一些其他的添加剂，主要是用来保护蛋白质不被破坏和增强其溶解性。
| 类型 | 功能 | 常用试剂 |
|---|---|---|
| 还原剂 | 防止氧化 |
|
| 蛋白酶抑制剂 | 防止内源性蛋白酶分解蛋白 |
|
| 金属螯合剂 | 使金属蛋白酶失活 |
|
| 精氨酸激酶 | 稳定蛋白质结构，增强溶解性 |
|
| 离子稳定剂 | 增强溶解性 | 盐类 （如NaCl、KCl、（NH4）2SO4 |
表二：蛋白质纯化中用于增强蛋白质稳定性的常用添加剂。
添加剂只在必要时才使用。可能需要多次尝试才能确定某些添加剂是否对一些特定蛋白质的纯化工艺有效。
其它因素
蛋白质纯化工艺中的其他因素也会对蛋白质的稳定性产生影响。对蛋白质的处理步骤越少越好，在最短时间内采用最少步骤的纯化工艺才能保证得到最高产率的活性蛋白质。而且，在整个纯化过程中，蛋白质最好都保持在低温状态。一般纯化过程都在4°C进行,因为这个温度既可以降低酶解速度（在含有蛋白酶的情况下），又可以保证蛋白质的结构完整性。
蛋白的分离纯化是生物工程下游阶段一个比较重要的部分，尤其在基因工程重组蛋白的分离纯化中，上游过程的许多因素会直接影响到下游蛋白的分离，充分利用上游对下游的影响，对蛋白的纯化做一个全面的考虑和整体的设计。是否带有亲和标签，His标签，GST标签等，不同的亲和标签选择不同的纯化方案；可能是可溶性表达，可能形成包涵体，可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离，纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难，需要对聚集的蛋白进行变复性，通常活性蛋白的得率比较低；是否对宿主细胞具有毒性，从而选择抗毒性的表达系统；怎样选择表达系统，是大肠杆菌表达系统，酵母表达系统还是CHO细胞表达系统，不同的表达系统和培养方法显著影响下游的处理过程，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外），蛋白表达的量都依赖于所选择的表达系统；蛋白的化学性质，是否容易被蛋白酶降解，是否会和一些金属离子，化学成分发生反应；蛋白的物理性质，是否对温度敏感等。从蛋白基因的获取，蛋白基因的克隆，蛋白的表达，做好一个整体的规划，将对纯化工作的方便快捷高效带来关键的影响。
基因工程构建的纯化标记有很多，通过改变 cDNA在被表达的蛋白的氨基端或羧基端加入少许几个额外氨基酸，这个加入的标记可用来作为一个有效的纯化依据。GST融合载体，蛋白A融合载体，含组氨酸标记（His-tagged）等，不同亲和标签的蛋白有不同的纯化方案。
亲和标签与目标蛋白之间的作用是相互的，需要综合的考虑，既要考虑到对目标蛋白结构功能的影响，又要考虑到对标签与其配体亲和作用的影响，以及实际的用途。
几种常规蛋白纯化标签比较
（1）亲和标签是否会影响到目标蛋白的结构和功能，大多数情况首选短的多肽标签，这是因为短的肽标签对目标蛋白的结构影响最小，而大的亲和标签可能限制重组蛋白的折叠，影响蛋白质的生物学功能。
（2）亲和标签对蛋白质稳定性的影响，亲和标签的加入是否会影响到目标蛋白的正确折叠，是促进目标蛋白的可溶性，还是容易形成包涵体，会不会造成氨基酸C和N端破坏，使目的蛋白表达不完全。
（3）亲和标签所融合的位置，亲和标签可以加在N端，可以加在C端，也进行串联。多数情况下蛋白质的N端区域对蛋白质的功能不是太重要，所以在N端进行融合标签的融合常常能保留蛋白质的生物学功能。由于N端DNA序列对蛋白质的转录翻译影响较大，所以标签加在N端对蛋白质的表达水平影响更大，优化标签的mRNA结构可使表达水平提高。可能有些蛋白纯化后需要去除亲和标签C端融合在去除融合标签后在目标蛋白的C端会有几个氨基酸残留，而小心的选择剪切特异性的氨基酸序列就可以在去除N端亲和标签后得到天然的目标蛋白。
（4）亲和洗脱的条件，有些条件比较温和，而有些条件较为剧烈，选择的亲和表达系统应该不使目标蛋白变性。
广泛使用的融合标签的分子量比较（来源：网络）
1.诱导方式:
诱导方式的选择上，为了得到正确折叠的目的蛋白，表达菌种的生长情况，菌种是否健壮，是否是单克隆菌种，菌体的浓度是否适合诱导，生长状态不好的表达菌，一方面会造成目的蛋白的错误折叠，造成蛋白大小，形态等发生改变，另一方面会因为IPTG的加入，导致菌体的死亡或者降解。
低温度诱导有助于蛋白二硫键的正确折叠，但对于高温表达的蛋白不适合低温状态，温度过高容易导致包涵体的形成。
2.诱导剂：
基因的诱导表达基于乳糖操纵子调节机制，没有乳糖存在的时候，阻碍物基因产生阻碍蛋白，阻碍蛋白和操纵子结合，抑制基因的表达；当有乳糖存在的时候，B-半乳糖苷酶和乳糖作用产生异半乳糖，异半乳糖和阻碍蛋白结合，解除抑制，激活基因，开始表达蛋白。诱导的浓度的高低对目的蛋白的表达也会有产生影响。BL21（DE3）, Rosetta(DE3)等大肠杆菌表达系统这些菌株都敲除了蛋白酶，并溶源了噬菌体DE3。DE3是的一种衍生λ噬菌体，带有噬菌体21抗性区和 lacI基因，lacUV5启动子，以及 T7 RNA聚合酶基因。这一区段被插入int基因，因此阻止了DE3在没有辅助噬菌体时整合到染色体上或从染色体切出。一旦形成DE3溶原状态，就只有受IPTG诱导的lacUV5启动子指导T7 RNA聚合酶基因转录，在溶原培养体系中加入IPTG诱导T7 RNA聚合酶生产，继而质粒上的目的DNA开始转录。
3.收获方式：
进行破壁之前应该选择合适的缓冲组分， 合适的pH 要结合酸碱溶液的滴定调节，尽量低的离子强度 ，加入一些稳定成分稳定成分，EDTA螯合重金属离子，Triton X-100，NP40等表面活性剂，保护非极性表面等。
4.确定蛋白质样品的形态，浓度 黏度 体积。
有时候得到粗蛋白的时候，会观是否符合目的蛋白的一些性质，确保得到是目标蛋白。粗蛋白的形态有没有明显的差异，浓度是否符合纯化的要求，是否有较多的干扰物质，核酸 色素 强结合成分。
5.优化表达条件
（1）重组蛋白不表达或者表达量低。如果重组蛋白不表达（包含体和可溶蛋白都没有）通过改变诱导剂浓度，诱导温度，时间等都不表达的时候，然后尝试更换菌株、质粒载体。
降低诱导后培养温度。重组蛋白表达得越慢，其折叠效果就越好，大肠杆菌在4℃时依然可以表达重组蛋白，而将培养温度降低至25-30℃就能显著改善蛋白折叠。此方法不适用于温度诱导的重组蛋白表达；
减少诱导剂。诱导剂浓度可以降低至1/10；选用Lac渗透酶缺陷型菌株，如Tuner、Rosetta等，也有很好的效果。这类菌株能够使进入每个细胞的诱导剂浓度相同。重组蛋白在所有细胞中的表达水平相当时，减少诱导剂的效果更好。
（2）检查密码子构成，使其适应宿主菌的密码子偏好。稀有密码子，尤其是位于重组蛋白N端的和大量集中的稀有密码子，会降低mRNA稳定性，显著降低翻译速度，引起翻译提前中止、翻译移码和突变。将这些稀有密码子（尤其是N端！）突变为宿主偏好的密码子，能够显著提高表达水平。改善蛋白稳定性。能够引起蛋白降解的因素很多，从蛋白自身性质到宿主性质不一而足，如果重组蛋白在表达时就被降解，表达量和稳定性就会受到很大影响。在大肠杆菌中表达重组蛋白，需要牢记N端法则：当N端第二个残基是Leu、Arg、Lys、Phe、Tyr和Trp时，重组蛋白半衰期只有2分钟，而小侧链的氨基酸残基，如Ala，则可以提高蛋白稳定性。因此在设计载体时，要特别注意第二个密码子，避免上述残基的出现。
处理高毒性蛋白：毒性极高的重组蛋白，其本底表达就会杀死原核宿主，质粒容易丢失，使其在大肠杆菌中很难得到高表达。采用可表达T7溶菌酶的宿主。T7溶菌酶是T7RNA聚合酶的抑制剂，采用含有T7溶菌酶质粒的宿主，如pLysS，可以降低重组蛋白在大肠杆菌快速生长期的本底表达量，在受到IPTG诱导时也能较好的表达蛋白。
（3）包涵体表达：包涵体蛋白折叠混乱、二硫键配对混乱、没有生物活性、变复性条件需要长时间摸索等，即使包涵体蛋白成功复性，其均一性和活性依然备受质疑。但是包涵体表达也有其优势：能够很轻松的获得超高的表达量，不可溶的重组蛋白不会被宿主内的蛋白酶降解，重组蛋白的毒性被大大抑制，杂蛋白含量低（~10%），容易纯化等。由于这些优点以及蛋白质复性条件的不断发展，表达包涵体蛋白逐渐为人们所接受，成为重组蛋白表达的一个常用方案。与可溶蛋白相反，提高培养温度、延长培养时间、在较高的菌密度下诱导都有利于包涵体的形成；在破菌和变性溶解时加入还原剂能够打开错配的二硫键；在复性液中加入二硫键异构酶、脯氨酸异构酶、分子伴侣和蛋白的辅助因子可以帮助重组蛋白折叠；精氨酸和高分子量PEG能减轻蛋白分子的聚集；尝试多种物理手段，如透析、快速稀释和柱上复性等，有时对复性有奇效。包涵体的表达相对简单，但其复性过程仍是依赖经验的，没有通用的方法可以套用。
表达体系对蛋白纯化的影响
开始纯化蛋白前应先制备初始样品。真正进行蛋白纯化的操作之前，首要考虑是目的蛋白的来源。样品来源可为原始样品，例如肝脏，肌肉或脑组织。当前，更为常见的是从重组来源的样品纯化蛋白质。一些重要决定需要提前考虑以便优化后续的纯化。研究者需要考虑蛋白质的最终用途（例如治疗性生物药，酶测定，结构研究，抗体生成），因为这将决定最终蛋白质制备所需的量和纯度。尽管蛋白质表达的详细讨论超出本文范围，但是在这一点上仍有几个值得考虑的基本点，因为它们直接影响后续的蛋白纯化。
如果选择大肠杆菌表达系统，最终目的可溶性表达或包涵体形式，由于包涵体中有高丰度的重组蛋白，包涵体的分离本身构成了纯化的重要步骤; 这必须与溶解难易和随后包涵体中再折叠靶蛋白的难易以及可溶性蛋白的最终产量相平衡 [1] 。已经有许多工作优化了从包涵体中产生功能蛋白的产量 [2] 。
另一个考虑是是否靶向胞内或胞外（分泌的）表达。胞内表达需要将蛋白质从大量宿主细胞蛋白中纯化而来。相比之下，特别是当宿主细胞在无血清条件下生长时 [3] ，目标蛋白的有效分泌要求蛋白必须从少量分泌的宿主蛋白中纯化而来。
初始样品制备
无论目标蛋白的来源如何，作为纯化的初始步骤，原始样品的制备很重要。同时也需要考虑表达和纯化策略。
目标蛋白的胞外分泌可使用简单快速亲和纯化方案 [3] ；所需的唯一样品制备可能需要倾倒贴壁细胞的条件培养基或者低速离心以去除悬浮细胞。当然，制备过程的第一步亲和层析时可能需要加入蛋白酶抑制剂或者调节pH，但这些步骤简单易行。然而，如果第一步纯化样品步骤进行离子交换，样品则可能需要首先脱盐或者缓冲液置换。
如果靶蛋白在胞内表达，则细胞首先需要通过离心获取，然后用合适的裂解缓冲液重悬。如上所述，裂解缓冲液需要包含合适的缓冲液和其它添加剂以确保靶蛋白的最大稳定性。如果研究者在柱层析之前避免耗时的缓冲液置换步骤，则样品/裂解缓冲液的组成也需与随后的纯化步骤相适宜。
接下来，需要有效的细胞裂解方法。大肠杆菌可以通过弗氏压碎器裂解（尽管这种方法不容易规模化），超声或基于洗涤剂的裂解（有很多商业裂解试剂）。通过向裂解缓冲液中加入溶菌酶可以改善基于洗涤剂的裂解效率。基于洗涤剂的裂解非常温和，且不导致细菌DNA的显着切变。因此，为了降低样品粘度产生具有良好流动特性的样品，通常需要加入核酸酶孵育（高纯度制剂可商购） [4] 。
哺乳动物和昆虫细胞也可以通过超声或基于洗涤剂的方法裂解。如果核膜显着裂解，可能需要核酸酶处理降低样品粘度 [4] 。
一旦细胞（微生物/昆虫/哺乳动物）被裂解，通常需要离心或者微滤除去细胞碎片（通常在4℃下15000×g离心15分钟，或者用0.22-0.45um的膜组件过滤，以避免层析柱堵塞） [4] 。所得上清液即可开始用于靶蛋白的柱层析纯化。
参考资料
免责声明
苏州蓝晓生物科技有限公司是蓝晓科技（股票代码：SZ 300487）全资子公司，依托蓝晓科技20多年在分离吸附材料领域丰富的经验和技术积累，在后疫情时代及药品集采的时代背景下应运而生。苏州蓝晓生物科技，在蓝晓科技雄厚资本的支持下，在蓝晓科技生命科学事业部数10年产品研发和技术积累的基础上，汇聚50多人的研发团队，提供从细胞培养及分离纯化到系统装置完整的解决方案，我们将全力助力生命科学及生物制药产业的高质量发展。
ID：seplife300487
电话：0512-65160522
