解析12种技术路线疫苗制备工艺

减毒活疫苗，通俗地说是将病毒或细菌的威力降低，不会让人生病，但又存活的状态。它能刺激人体的免疫系统产生反应，其全过程类似轻型或没有症状的感染。

目前使用的减毒活疫苗由卡介苗、麻疹风疹腮腺炎减毒活疫苗、乙脑减毒活疫苗及甲肝减毒活疫苗等。

裂解病毒疫苗（splitvirus vaccine）是将培养的病毒使用乙醚，脱氧胆酸钠等裂解剂裂开病毒脂膜，成为含有病毒表面抗原血凝素和神经氨酸酶，核壳及基质蛋白的可溶性碎片，同时将病毒的主要毒力蛋白去除制备而成，因此，裂解流感疫苗保留了免疫原性的同时降低了不良反应概率。

裂解病毒疫苗沿用至今，目前市场上签发的流感疫苗，以裂解疫苗为主。

裂解病毒疫苗制备工艺是先制备病毒，纯化后的病毒裂解后用蔗糖密度梯度离心，超速离心，UF/DF的方式进行纯化制备而成。

病毒载体疫苗的原理是将病原病毒的抗原如新冠的刺突糖蛋白（S蛋白）基因重组到经改造的病毒如复制缺陷型的人5型腺病毒基因内，基因重组腺病毒在体内表达新冠病毒S蛋白抗原，诱导机体产生免疫应答。

目前研究最多的三种载体病毒为：腺病毒，减毒流感病毒，新城疫病毒，在新冠疫苗研究上，这三种载体病毒被广泛用于新冠病毒载体疫苗的制备。

病毒载体疫苗制备工艺和减毒活病毒制备工艺基本一致，纯化所用填料也一样。如腺病毒及减毒流感病毒纯化常用工艺都是Q Large Scale +Seplife Suncore 700两步层析纯化法制备。

纳米颗粒疫苗可展示多重不同优势抗原表位从而诱导更强更广谱的免疫保护，故纳米颗粒疫苗备受关注。已发现多种纳米颗粒可用于疫苗制备，包括无机纳米颗粒（金、碳、二氧化硅）、聚合物纳米颗粒、病毒样颗粒（VLP）、脂质体（生物降解的磷脂组成的单层和多层囊泡）和自组装蛋白纳米颗粒等。

纳米颗粒疫苗制备分为两部分，分别制备纳米颗粒及病毒抗原，在通过共价结合、吸附（在纳米颗粒表面）和包封（在纳米颗粒内）将病毒抗原递呈在纳米颗粒上。

图6：纳米颗粒递呈病毒抗原的三种方式（来源搜狗图片）

纳米颗粒种类不同制备工艺相差比较大，VLP是制备纳米颗粒疫苗应用最广泛的纳米颗粒，其制备工艺参考VLP制备工艺。病毒抗原制备工艺参考蛋白疫苗制备工艺。纳米颗粒结合病毒抗原后在通过凝胶过滤层析Seplife 4FF或着多模式层析Seplife Suncore 700/400的方式去除游离的病毒抗原，纯化后除菌过滤并制剂化制备而成。

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DNA疫苗是一种将外源性抗原基因插入表达系统质粒中，再将质粒导入体内，让其在宿主细胞中表达抗原蛋白，诱导免疫应答从而刺激自体免疫，最终达到预防疾病效果的新型疫苗。

DNA疫苗系外源基因克隆至表达载体而成的重组质粒，可直接注入人体，利用树突状细胞MHC-I与MHC-II产生抗原，从而诱导细胞免疫与体液免疫。尽管DNA疫苗自2005年以来就被许可用于兽用疫苗，但由于转染效率低，在人类临床试验中表现不佳，随着新型佐剂系统（例如纳米颗粒）的研发，DNA疫苗技术逐步应用于人用疫苗。

DNA 疫苗目前全球尚无产品上市，临床研究集中于肿瘤（前列腺癌、宫颈癌、乳腺癌等）与传染病（HIV、流感、肝炎等）。

 DNA疫苗制备工艺

 1.大肠杆菌发酵，裂解，裂解液中和，收获pDNA:略

2.scDNA的分离纯化

scDNA溶液中HCP,RNA,ocDNA及内毒素都是层析工艺阶段要去除的杂质，质粒大小、序列、表达量、稳定性、杂质含量等的差异影响层析纯化过程，随着技术的发展scDNA纯化也呈现多种工艺路线。两步层析法选用多模式层析Seplife Suncore 700去除住宿DNA,RNA,HCP内毒素等杂质，在配合芳香嗜硫亲和层析Seplife Plasmid LX去除ocDNA即可满足超螺旋质粒制品的质量要求。

三步层析法制备scDNA

三步层析法是先用Seplife 6FF凝胶过滤层析去除RNA及HCP，在用Seplife Plasmid LX去除ocDNA，最后用Seplife LXMS 30Q去除内毒素的工艺过程（如图2），更多关于三步层析法纯化scDNA请查看《超螺旋质粒DNA GMP条件纯化手册》。

图7:蓝晓科技三步层析法制备scDNA

二步层析法制备scDNA

二步层析法选用多模式层析Seplife Suncore 700去除住宿DNA,RNA,HCP内毒素等杂质，在配合芳香嗜硫亲和层析Seplife Plasmid LX去除ocDNA即可满足超螺旋质粒制品的质量要求（如图3），更多关于二步层析法纯化scDNA请查看《二步层析法纯化超螺旋质粒工艺过程》

图8:蓝晓科技三步层析法制备scDNA

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mRNA疫苗是通过特定的递送系统将表达抗原靶标的mRNA导入体内，在体内表达出蛋白并刺激机体产生特异性免疫学反应，从而使机体获得免疫保护的一种疫苗。mRNA制备工艺如图1：提取表达抗原的mRNA，在经反转录得到表达抗原的DNA,把此DNA进行PCR扩增，扩增后进行基因重组，重组进质粒中，将质粒转化进大肠杆菌中，随着大肠杆菌的高密度发酵制备出携带目的DNA的质粒，大肠杆菌发酵后，经菌体收集，菌体裂解，裂解液澄清，在经三步层析法纯化出纯净的质粒DNA，得到的质粒经限制性内切酶将目的DNA从质粒中切除下来，经纯化后就可得到纯净的目的DNA，用逆转录酶将DNA体外转录成mRNA,转录翻译后用 dT 亲和层析填料纯化mRNA,纯化的mRNA进行LNP包被就完成mRNA疫苗的制备。

图9：mRNA疫苗制备全工艺流程（来源网络)

 mRNA疫苗制备工艺

 1.scDNA制备，参考DNA疫苗制备

2.mRNA制备

制备的scDNA，经酶切得到线性化的DNA，在经阴离子交换层析DEAE Large Scale HP或者Seplife LXMS 30Q分离纯化得到目的DNA,DNA在转录酶的作用下，将DNA转录成mRNA如图10.

图10：在转录酶作用下DNA转录成mRNA

转录后再经Seplife Oligo dT 亲和层析纯化，纯化后在加帽酶的作用下，mRNA经过加帽反应，反应后再次经Seplife Oligo dT亲和层析纯化，即完成了mRNA的制备，mRNA在经LNP包被（如图11）就完成mRNA疫苗的制备。

图11：mRNA LNP包被

mRNA纯化

图12：蓝晓科技mRNA纯化工艺过程

Seplife Oligo dT是蓝晓科技自主研发的一种新型高刚性聚合物亲和填料，主要用于捕获mRNA。Seplife Oligo dT以聚苯乙烯为基质，具有均一的超大孔径，表面进行了特定的长链间隔臂修饰并键合了自主开发dT配基，具有较高的载量和特异性结合力，非特异性吸附低，可耐受高温（65℃）,现以广泛用于mRNA的纯化。更多关于mRNA纯化请查看《Oligo dT亲和填料，赋能mRNA制品高质量制备》。

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将病毒的目的抗原基因构建在表达载体上，将已构建的表达蛋白载体转化到细菌、酵母或哺乳动物或昆虫细胞中，在一定的诱导条件下，表达出大量的抗原蛋白，通过纯化后制备的疫苗。

以新冠亚单位疫苗为例，解析蛋白疫苗制备工艺：

1.基因序列设计，克隆，发酵表达，收获抗原，澄清：略

2.RBD二聚体纯化工艺参考图13

图13：新冠亚单位疫苗纯化工艺

重组蛋白亚单位疫苗制备工艺，不同表达形式及不同aa序列纯化工艺相差较大，在纯化时可参考重组蛋白纯化思路和方法开发纯化工艺。

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病毒样颗粒(Virus-likeParticles，VLP)为病毒单一或多个结构蛋白自我组装形成的高度结构化蛋白颗粒，其在形态结构上与相应的天然病毒具有高度一致性，因此具有较强的免疫原性、特异性及生物活性。

VLP不含有病毒的遗传物质，不能自主复制，不具备传染性，具有较高的安全性。其进入机体可诱导机体产生高滴度抗体，引发免疫反应 。

VLP表达系统选取多样(可使用细菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞)，制备成本低，可大规模生产。

目前我国使用的VLP疫苗有重组乙肝疫苗、重组EV71，重组HPV疫苗，重组诺如病毒疫苗等。

VLP疫苗有表达后是蛋白的，先纯化蛋白，然后体外组装，表达出来是蛋白纯化工艺参考重组蛋白纯化工艺，另一种是表达出来后就是VLP，在纯化工艺上和蛋白有较大差异，主要通过大孔离子交换层析，疏水层析及凝胶过滤层析纯化。

诺如病毒VLP疫苗纯化：澄清的原液先用单分散高分辨率高耐盐型阳离子交换填料Seplife LXMS 50HS(粒径50um，孔径150nm）捕获及初步纯化，去除大量的HCP等杂质，洗脱液经UF/DF脱盐及置换缓冲液后再用Q Seplife FF进行精细纯化，去除痕量杂质及内毒素。

酵母表达乙肝疫苗

构建含有乙肝病毒HBsAg基因的重组质粒，转入酵母（啤酒酵母. 汉逊酵母或毕赤酵母）表达的乙型肝炎表面抗原，在繁殖过程中产生于未糖基化的HBsAg多肽，经破碎酵母菌体，HBsAg未糖释放，破碎后的上清液经深层过滤等方式进行澄清处理，澄清后先用Butyl Seplif 4B捕获及初步纯化，初步纯化后经DEAE Seplife FF中等纯化，中等纯化后在经Seplif 4FF精细纯化，纯化用S/D等方式灭活病，UF/DF等方式调整浓度及置换冲液后加氢氧化铝后制成。

图2：蓝晓科技Butyl Seplife 4B纯化乙肝疫苗

酵母表达的乙肝VLP疫苗纯化常用填料

Butyl Seplife 4B 

用于酵母表达HBsAg捕获及初步纯化，快速从酵母裂解液中分离出HBsAg。

DEAE Seplife FF

用于HBsAg的中度纯化，去除大量HCP等杂质。

Seplife 4FF

用于HBsAg的精细纯化，去除痕量HCP等杂质。

CHO表达乙肝VLP疫苗

CHO表达的HBsAg和酵母表达纯化工艺略有差异，两者表达HBsAg糖基化有所差异，在捕获及初步纯化时，CHO-HBsAg-VLP选用疏水力更弱的Butyl-S Seplife 4FF层析填料，其它纯化过程基本一致。

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用细菌液体发酵法进行多糖疫苗的制备,发酵液经甲醛杀菌后,用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）沉淀多糖去除核酸，CTAB——多糖沉淀加入终浓度1M的氯化钙溶液是沉淀溶解，溶解后的加入乙醇至终浓度为25% 2-8℃静置8小时，然后离心收集上清液即为多糖液。多糖液加入冰乙醇至终浓度为80%，沉淀多糖并用无水乙醇或者丙酮洗涤多糖粗品。

目前我国使用的多糖疫苗，主要有流脑多糖疫苗，肺炎多糖疫苗，b型流感嗜血杆菌荚膜多糖疫苗等。

流脑多糖的纯化

多糖粗品溶解后，用冷酚沉淀蛋白后再次用冰乙醇沉淀多糖去蛋白纯化多糖的传统方法趋于淘汰。随着技术和材料的发展，多糖粗品溶解后加入蛋白酶k（Proteinase K）降解蛋白并配合层析技术及UF/DF技术纯化多糖是发展趋势。常用的层析填料有阴离子交换层析填料DEAE Seplife FF及多模式阴离子交换层析填料MA Large Scale及凝胶过滤填料Seplife G-25 M等。

流脑多糖纯化常用填料

DEAE Seplife FF:琼脂糖微球阴离子交换层析填料多用于粗多糖溶解后用蛋白酶K降解蛋白后流穿模式纯化多糖。

MA Large Scale：高刚性琼脂糖微球多模式阴离子交换填料多用于流脑多糖的吸附洗脱模式纯化。

Seplife G-25 M:主要用于生物分子脱盐及缓冲液置换。

其它多糖疫苗纯化和流脑多糖疫苗纯化工艺基本一致，可参考流脑多糖疫苗纯化工艺。

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多糖结合疫苗是指具有可变结构和数量的多糖单元与非糖单元 ( 蛋白质或短肽、脂类 ) 通过共价连接形成的疫苗，以蛋白质 - 多糖结合疫苗为主。多糖结合疫苗的开发策略是借助非糖单元如蛋白质等与多糖抗原共价结合，将多糖抗原转换为胸腺细胞依赖抗原 (T-dependent antigen, Td)。

目前我国使用的多糖结合疫苗，主要有流脑多糖结合疫苗，肺炎多糖结合疫苗，Hib多糖结合疫苗等。

目前多糖结合疫苗主要使用5种载体蛋白：

破伤风类毒素（tetanus toxoid，TT）

白喉类毒素（diphtheria toxoid，DT）

流感嗜血杆菌外膜蛋白（H. influenzae protein D, HiD）

白喉毒素的交叉反应物 (cross-reactingmaterial, CRM197)

脑膜炎耐瑟球菌外膜蛋白复合物 (meningococcal outer membrane protein complex, OMPC)

各载体蛋白纯化工艺可参考重组蛋白纯化工艺，由于上游工艺不同，纯化工艺路线差异较大，主要通过离子交换及疏水层析进行纯化。

多糖—蛋白结合后纯化：多糖——载体蛋白结合后，去除游离的多糖及蛋白可用疏水层析，多模式层析及凝胶过滤进行纯化。推荐疏水填料Seplife LXPM Phenyl 5504M，多模式填料MA/MMC Large Scale等。

多糖结合疫苗纯化常用填料

Seplife LXPM Phenyl 5504M:高分辨率聚甲基丙烯酸酯微球填料，广泛用于生物分子的分离纯化。在结合疫苗纯化终用于去除游离的多糖及载体蛋白。

MA/MMC Large Scale :高刚性琼脂糖微球填料，以离子交换作用为主，同时兼具一定的疏水作用力，广泛用于聚集体，疏水差异较小的生物分子的分离纯化。

Seplife 4FF :琼脂糖微球凝胶过滤介质，在肺炎多糖结合疫苗纯化中广泛使用，用于去除游离的多糖及载体蛋白。

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多肽疫苗是按照病原体抗原基因中已知或预测的某段抗原表位的氨基酸序列，通过化学合成技术制备的疫苗。多肽疫苗由于完全是合成的，不存在毒力回升或灭活不全的问题。

多肽疫苗制备工艺：

可参考GLP-1R合成方式，有液相合成和固相合成两种合成方式，固相合成可使用蓝晓科技固相合成载量，合成后通过离子交换层析，疏水层析及反向层析进行纯化。

多肽纯化离子交换填料：

Seplife LXMS 15/30 S/Q:单分散聚合物离子交换层析填料，耐压可达3Mpa，广泛用于多肽及小分子物质的分离纯化。

Seplife RP LXMS 10/15(100)：聚合物反向层析填料用于多肽的精细纯化。     

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