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被内毒素虐哭了
我们有去除内素素的介质么？
用您推荐的阴离子介质去内素素效果不好？
内毒素怎么去除啊？
您那里有去除内毒素的方法吗？
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内毒素的去除——摒弃幻想
内毒素是复杂的混合物，不同来源的内毒素差异较大，而且同一样品中不同的内毒素分子之间差异较大，内毒素的去除是一个系统工程，涉及到很多方面，所以我们先要摒弃幻想，其它不管不问就希望有一款层析介质过一下就可以去除内素素这个幻想不太现实，没有那种介质过一下就可以万事大吉的可能，要科学的认知内毒素及内毒素的去除。
内毒素的去除——科学认知
我们在去除内毒素之前，要明确内毒素来源那里，它有哪些特性，然后我们要明确我们所做的项目去除内毒素的要求，样品中内毒素的含量，我们目标物质的制备工艺，然后结合这些去合理的设计去除内毒素的工艺。
➤内毒素的去除是一个工艺过程，既然是工艺过程，就涉及到工艺的各个方面，而层析介质只是工艺中的一部分，层析介质有去除内毒素的作用，但是并能决定能否去除内素素。
➤基于第一点，很多介质都具备去除内素的作用，如离子交换及疏水层析介质，但是必须结合合理的工艺过程，才能达到去除内素素的目的。
➤内毒素是复杂的混合物，在整个工艺中从源头就要将内毒素去除设计进去。每一步工艺过程去除一点，更要在无菌操作环境，无热源器皿中操作。
1.内毒素的去除是系统工程，每一步都要考虑。
2.保证工艺过程的环境器皿的洁净无热源，避免交叉污染。
3.内毒素是复杂的混合物，不同来源的内毒素性质差异较大，同一来源的，不同分子之间性质差异也较大，所以内毒素去除没有通用的方法。
4.内毒素的去除通常和各种方法配合使用，如离子交换层析加纳滤，疏水层析加凝胶过滤层析等。
内毒素是什么
内毒素是包在革兰氏阴性细菌外膜中的脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS），LPS是革兰氏阴性菌细胞膜上的主要结构成分，包被约四分之三的外膜，LPS由多糖O抗原(O-PS)、核心多糖(C-OS)和类脂A(Lipid A)构成。O-PS由2～6个寡聚糖组成，是LPS中最容易发生变异的部分，由于细菌种类不同所以多糖O-PS组成亦不同；C-OS主要的作用是连接类脂A和O-PS,由己糖、庚糖、2-酮基-3-脱氧辛酸等组成。类脂A是LPS中最小的结构单位，也是最为保守的部分，同时也是LPS的活性中心，决定着细菌的致病性，其成分是由氨基葡萄糖双糖构成的亲水性骨架和疏水性脂肪酸链组成的磷脂。迄今为止，多种细菌类脂A的化学结构已被测定，主要不同之处在于脂肪酸和磷酸基团的差异。
类脂A体积小且质轻，细菌内毒素耐热性很好，LPS中性溶液在室温下可放置数月，其生物活性不发生明显改变，如置入4℃或低温冰箱，则其生物学活性可保持数年至数十年不变，干燥的LPS中性粉剂，在室温或冰箱条件下可放置几十年或更长时间而不失去生物活性，在120℃高温下加热4h时仅能破坏98%，要完全灭活需在180℃高温下，加热2小时以上，这样的去除方法实施起来有相当的难度，一般的化学药品也不会影响细菌内毒素的活性，只有强酸、强碱或强氧化剂可以破坏细菌内毒素的结构。
内毒素的去除——超滤法
内毒素的相对分子质量在10KDa以上，选择合适的超滤膜孔径即可将其去除，该方法特别适合从产物的相对分子质量较小的溶液中去除内毒素，通常只适合目标分子小于5KDa的物质去除内毒素。
内毒素的去除——萃取法
向含有内毒素的溶液中加入表面活性剂如Triton X-114，当表面活性剂的浓度超过它的临界胶束浓度时，内毒素分子中类脂A中的烷基链部分与表面活性剂通过非极性相互作用结合成胶束，与水分离，当温度高于浊点时，胶束聚集成含水量很小的胶状液滴，通过离心法进行分离，也可以进一步升高温度，使富表面活性剂的胶粒进一步生长，在溶液中沉淀，通过多次萃取，直到内毒素的浓度达到目标为止。低附加值生物制品下游工艺过程Triton X-114广泛用于内毒素的萃取。
内毒素的去除——离子交换层析法
内毒素在pH4-8范围都带负电荷，离子交换色谱法成本低，吸附容量大，简单有效，生物制品制备工艺过程种离子交换层析被广泛用于内毒素的去除。
➤碱性蛋白在中性pH环境中带正电荷，用阴离子交换层析流穿模式，目标蛋白流穿，内毒毒结合在阴离子交换填料上，推荐阴离子交换填料Q Seplife FF/XL，Seplife LX-MS-30Q，酸性蛋白也可以用阳离子交换层析填料SP Seplife FF/XL，Seplife LX-MS-30SP结合目标蛋白，让内毒素流穿实现分离。
➤pI大于5的蛋白在中性pH环境下，目标分子和内毒素都带负电荷，结合在阴离子交换介质上，洗脱时通过改变pH的方式洗脱，不同pH洗脱不通物质实现分离
➤pI小于5的酸性蛋白在pH中性环境下，目标和内毒素都带负电荷，结合在阴离子交换介质上，洗脱时通过同时改变pH和离子强度促使两种物质在不同条件下洗脱下来。
应用案例：
用蓝晓科技离子交换填料Seplife LXMS 30Q去除制备mRNA疫苗原料的超螺旋质粒（scDNA）纯化中精纯阶段的内毒素。
层析条件：
层析填料：Seplife LXMS 30Q
样品：用Seplife 6FF填料去除RNA在用Seplife Plasmid XL去除ocDNA的scDNA，pH7.5
平衡液：100mM Tris-HCl, 10mM EDTA, 0.4M NaCl, pH=7.5
洗脱液：100mM Tris-HCl, 10mM EDTA, 1M NaCl, pH=7.5
柱床体积：5ml
流速：1ml/min
再生液：1M NaOH
纯化结果：一步层析后内毒由原2000 EU/ml降到0.5EU/ml,scDNA回收率大于90%，满足生物制品工艺要求。
图1：Seplife LXMS 30Q去除scDNA溶液中的内毒素色谱曲线(scDNA高密度电荷和离子交换层析作用力强，内毒素在0.4M NaCl环境中流穿，从而实现分离)
内毒素的去除——疏水层析法
内毒素主要成分类脂A比一般蛋白有更强疏水性，在疏水层析介质种如Phenyl Seplife FF,用高盐如1.5M硫酸铵平衡柱床，并将待去内毒素的样品盐浓度调至1.5M,内毒素在高盐环境中聚集，上样时流穿，而目标分子结合在疏水层析柱中，从而实现分离。同时，在较低盐浓度时如0.5M硫酸铵环境中，目标分子流穿，内毒素被结合在疏水柱床中。
内毒素的去除——凝胶过滤层析
内毒素在0.4M硫酸铵等盐的环境中，聚集成超大分子，通常大于1000KDa,而目标分子相对很小，可以通过凝胶过滤层析分离，如IgG中内毒素，可以用Seplife S-200去除内毒素。
内毒素的去除——亲和层析
以内毒素的类似物多粘菌素B为配体，键合在琼脂糖微球，特异性的结合内毒素，以去除生物制品中的内毒素，但这种方法主要用于科研及微量样品中内毒素的去除，工业生产中，因内毒素性质复杂，每个内毒素分子之间性质差异较大，这种亲和层析的去除效果大打折扣，且成本昂贵，亲和层析去内毒的方法受到限制，工业上主要还是用离子交换层析法去除内毒素。
参考资料
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