单细胞+时空原位分析探索早期人类胎儿肺上皮细胞可塑性的时间动态∣时空原位研究范式

前言

单细胞测序具有单细胞分辨率，但缺乏相应的空间背景信息，而Visium数据具有空间背景信息，但达不到真正的单细胞分辨率。目前单细胞和空间转录组相互弥补，常用的是通过转录本分布预测和细胞类型反卷积进行两者的联合分析，得到空间层面的细胞聚类结果，但是仍然缺乏在空间背景下准确的转录本在特定细胞中的定位信息。

Xenium基于多模态染色的方案，完美的在空间层面上将组织学和基因表达的数据定位在一张图谱中，展示出高复杂性、高通量、多模态的空间和细胞分辨率的数据。

研究背景

单细胞技术正在重新定义典型细胞类型的分子特征，并在器官和组织中识别新的细胞类型和细胞状态。成年人肺系统的单细胞图谱已经阐明关键细胞类型在体内平衡和某些疾病中的作用，但对发育中胎儿肺的细胞的理解很大程度上是从小鼠研究中推断出来的。

近期虽已有研究利用单细胞转录组来表征发育中的人类胎儿肺组织，确定了肺细胞类型和细胞分布的物种特异性差异，并且从妊娠早期至中期胎儿获得的少量正常胎儿肺数据集中发现了一些新的细胞类型和细胞谱系轨迹。但由于缺乏相关的易于操作的实验模型，这些观察结果及其对出生后肺功能潜在影响的后续研究难以进行。

2024年6月，来自多伦多儿童医院的研究团队在Nature Communications上发表题为“Early human fetal lung atlas reveals the temporal dynamics of epithelial cell plasticity”的文章。该研究通过单细胞转录组测序，从高表达囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）的祖细胞中捕获了动态发育轨迹，这些细胞产生多种特殊的上皮细胞类型。结合空间组学，显示关键信号通路的时间调节，可能驱动特化上皮细胞包括纤毛和肺神经内分泌细胞的时间和空间出现。最后，作者发现人类多能干细胞衍生的胎儿肺模型含有 CFTR 表达的祖细胞，且捕获到在天然组织中确定的类似谱系发育轨迹。总的来说，本研究提供了发育中人肺的全面单细胞图谱，概述了细胞谱系发育的时间和空间复杂性，并对从人类多能干细胞分化到类似发育阶段的胎儿肺培养物进行了基准测试。

技术路线

本研究总共收集了19例妊娠10-19周健康的人类假腺体胎儿肺组织进行单细胞测序，并对15周和18周样本进行了空间转录组和Xenuim检测；并将自然胚胎和hPSC分化来源单细胞数据进行比较验证。

主要研究结果

1. 人胎儿肺细胞图谱

作者对单细胞测序产生的156,698个高质量细胞进行分析共注释到5种主要细胞大类，包括基质细胞( COL1A1，COL1A2) ，上皮细胞( EPCAM) ，内皮细胞( PECAM1) ，免疫细胞( CD74，CD3，NKG7)和施万细胞( NRXN1，S100B，PLP1)；进一步的亚群分析共获得58种不同的细胞类型/状态(图1B-D)。

作者还使用 Xenium 平台检测了 GW15和 GW18 2例人胎肺组织上基因的空间表达（人肺panel 289个基因+50个定制基因），分析结果显示在 GW15中发现了9个主要cluster，在 GW18中发现了7个主要cluster；并对注释的clusters进行空间映射，以显示其不同区域分布(图2 F-K)。

 图1 19例胎儿肺组织单细胞转录组测序数据集综述

上述结果可通过联川星云绘制

图2 GW15和GW18 两例胎儿肺组织Xenium分析

2. 胎儿肺上皮的动态演变

胎儿肺上皮细胞亚群分析共获得19个亚型，除了在 GW13周围出现的纤毛细胞前体，成熟的纤毛细胞和在 GW14周围出现的 SCGB3A2+ FOXJ1+ 细胞之外，许多上皮细胞类型都在所有肺组织中被发现（图 3A）。

作者鉴定了四种 CFTR 表达相对较高水平的上皮细胞类型，包括 NKX2-1+ SOX9+ CFTR + ，SOX2^high CFTR+ ，SOX2^low CFTR+ 和 SCGB3A2+ SFTPB+ CFTR+ 细胞（图 3C）。既往对猪胎肺的研究表明了 CFTR 在分支形态发生中的作用，而其在发育肺中的多效性作用仍有待确定。DEGs分析显示，这几种细胞类型与肺发育相关。

Xenium分析显示 NKX2-1+ SOX9+ CFTR + 仅限于上皮，在肺组织的分叉区域或发育芽区域中富集了三种基因的表达。相比之下，SOX2+ CFTR+ 细胞在气道的茎部区域被发现。已知 SOX2 表达调节上皮细胞的细胞生长，SOX2^high CFTR + 细胞可能参与细胞的扩张，形成发育中的气道。SCGB3A2+ SFTPB+ CFTR+ 三阳性（TP）细胞差异表达更高水平的 CXCL17，CP 和 CYB5A，以及NOTCH的靶基因，差异的高调节活性转录因子 HES1；和 ASCL2，既往研究为肠上皮中 WNT/CTNNB1的转录靶标；这些 TP 细胞被发现大量分散在整个气道(图3D-E)

图3 表达CFTR祖细胞的空间鉴定

3. 推断上皮亚型的轨迹

作者使用 RNA 速率等分析来预测上皮细胞类型的谱系关系(图6A)，通过对晚期组织分析发现了从芽尖祖细胞通过 TP 细胞到成熟纤毛细胞，PNEC 和基底/俱乐部细胞的轨迹。进一步鉴定了三种终末状态: 成熟纤毛细胞，PNEC 和芽尖祖细胞；确定了早期芽尖祖细胞向晚期芽尖祖细胞或尖细胞和 NKX2-1+ SOX9+ CFTR+ 细胞的分叉(图4B)。

作者分析观察到的轨迹表明高度的细胞可塑性和细胞谱系关系的变化(图4C)，并基于几种典型细胞类型的出现，将组织分为3个阶段: 早期(GW10-13) ，中期(GW14-16)和晚期(GW17-19)。晚期标志着肺发育的早期小管阶段，在这个阶段出现许多上皮细胞亚型的分化和出现。在早期妊娠组织中，有多种来源的 PNEC 贡献，包括从芽尖祖细胞通过尖细胞到 SOX2^high CFTR+ 到 TP，然后是 PNEC 的轨迹。在妊娠中期组织中有几条轨迹汇聚到 TP (图4E)，包括 SOX2^low CFTR+ 细胞，SOX2^high CFTR+ 细胞，基质样细胞2细胞，增殖祖细胞和基底细胞；且在所有时间点观察到 NKX2-1+ SOX9+ CFTR+ 和 SOX2^lowCFTR+ 或 SOX2^highCFTR+ 细胞之间的强连接，以及后两种细胞与 TP 的连接，表明这些细胞是发育相关的。在中期(GW14-16)时间点，观察到成熟纤毛细胞的出现和轨迹，从芽尖祖细胞通过尖端细胞，NKX2-1+ SOX9+ CFTR+ 到纤毛前体细胞或通过 SOX2^high CFTR+ 细胞，TP 细胞和 SCGB3A2+ FOXJ1+ 细胞到成熟纤毛细胞(图4G)。

图4 RNA速率分析揭示上皮细胞随胎龄变化的动态轨迹

4. hPSC来源的胎儿肺分化捕获到天然组织中发现的细胞异质性和轨迹

作者对 hPSC来源的胎儿肺细胞和类器官进行单细胞转录组测序，与天然组织比较的DEGs、Spearman分析发现明显重叠和相关性，进一步的轨迹追踪捕获了一些类似的上皮细胞类型/状态和轨迹。

图5 hPSC来源胎儿肺细胞和类器官的单细胞特征

简言

Visium 和Xenium并不是“非此即彼”，而是相辅相成，通过Visium 来建立健康或疾病状态下的组织空间和基因图谱，然后采用为研究定制的Xenium基因panel进行更精细的研究机制拆解。

参考文献

[1] Quach H, et al. Early human fetal lung atlas reveals the temporal dynamics of epithelial cell plasticity. Nat Commun. 2024 Jul 13;15(1):5898.

关于联川

杭州联川生物致力于为全球各地的科研用户提供基因组、转录组、表观组、蛋白组、代谢组，以及单细胞和空间组学测序服务。

单细胞和空间转录组测序作为联川重点科研服务产品，目前已经搭建完成包括10x单细胞测序（ScRNA-seq、ScRNA-seq＆VDJ及ScATAC seq），10x空间转录组测序（Visium 、CytAssist），10x Xenium及华大时空组学（stomics）测序平台。联川生物实现从nm到um，从单细胞到亚细胞的全生态单细胞空间原位检测的布局。在样本制备和生物信息学分析，以及云分析平台方面充分发挥自身优势，联川生物致力于为客户提供优质的服务。

目前已经与多个国家及地区的100多个科研院校、医院、制药公司建立起了长期的合作伙伴关系，累计发表单细胞和空间转录组测序相关的SCI高质量论文已超过百篇，影响因子平均15+，其中空间转录组相关文章数十篇（包含单细胞&空间转录组联合分析文章）。联川在单细胞&空间组学整合分析具备成熟的流程和云分析工具，对于数据挖掘和生物学故事具备深度的理解力，是值得信赖的多组学整合专家！

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