国自然热点2025：时空组学实验流程和样本如何准备？
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2024-11-08 16:37
浙江
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空间转录组（Spatial Transcriptomics）是测量完整组织切片的总mRNA，将总mRNA的空间信息与形态学内容相结合，以明确定量和定位组织中的细胞，并绘制所有基因表达发生的位置，获得生物过程复杂而完整的基因表达图谱，以了解基因在不同细胞、组织及不同时刻的活跃状态，同时还允许在这种空间环境中发现信号传导和调节分子，从而揭示对细胞结构和功能的新见解。为研究人员提供了前所未有的能力来揭示组织内复杂的基因表达模式，开创了从发育生物学到疾病研究等跨学科理解的新时代。空间转录组具有更多的技术体系选择性，对于不同的场景应推荐不同的技术路线。有基于polyA捕获的10x Visium及华大时空平台，也有采用探针法进行基因的杂交和表达检测10x Cytassist、10x HD、10x Xenium等平台。以下为各个平台各个技术平台的实验流程说明。空间转录组学的样本使用范围十分广泛，覆盖新鲜组织包埋剂速冻后的冰冻组织（Fresh Frozen，FF）、新鲜组织多聚甲醛固定后的冰冻组织（Fixed Frozen，FxF）、以及石蜡组织（Formalin Fixed Paraffin Embedded，FFPE）。具体的产品类型对应样本适应范围如下表所示： 组织的时空研究重点是空间结构与空间表达之间的关联，强调瞬时的表达水平与组织细胞空间构象之间的真实关联性。因此，组织在某个时间和空间的固定至关重要，影响检测所需的组织形态以及核酸完整性。FF组织一般是组织离体后尽快采用液氮速冻或者OCT包埋固定成组织块，后在低温条件下保存以及切片贴片，低温将保障其形态及核酸的稳定性，但反之保存条件的不恰当以及冻融，将产生显著的不稳定性。尤其人来源的组织一般是手术取出，从取出到实验室处理包埋成FF组织，极有可能经过一段时间，该时间段内的保存一般是采用PBS或者保存液，如单细胞转录组研究经常使用的美天旎组织保存液。这些溶液并不具备组织固定功能，而更多侧重维护细胞组织生理状态。因此，FF组织在离体后的这些阶段可能组织形态和核酸完整性已经受到破坏性影响。例如肾脏组织、肠道组织等代谢旺盛的组织；发生炎症的皮肤组织等类型；易发生坏死的脑胶质瘤组织，其FF组织在核酸质控阶段易被淘汰。同时，FF组织还容易发生由于水分未处理干净、或本身组织含水量高等原因，导致冰晶产生，影响组织形态；富集冰晶的区域，将在空间表达前的组织染色、透化环节释放脱出核酸，导致该区域表达被拉低。对于肺、胃、心脏和肠等需要保持结构形态，可进行包埋前包埋剂灌注。 FFPE、FxF样本因在取材后即进行固定，保持了组织原有的形态，固定使蛋白质凝固，终止或减少分解酶的作用，从而降低组织内核酸的降解及组织细胞的抗原免疫活性。尤其对于含水量较高的组织类型（如眼球、肝脏等），因新鲜冻存会形成组织内冰晶；对于易发生自溶或异溶的组织（如胰腺、皮肤等），新鲜冻存也会使组织RNA降解；对于组织形态要求较高的组织（如肺、血管、胆管等），新鲜冻存时包埋剂灌注难度较大；对于钙化严重需要脱钙处理的组织（如骨、软骨等），新鲜组织脱钙处理过程中造成组织RNA降解，因此，对于能采用固定方式进行空间多组学研究的物种（对于10x Genomics空间转录组CytAssist平台为人和小鼠），我们建议FFPE或FxF的形式进行样本制备。 若是临床采集的样本无法立即进行后续处理，需将组织保存于预冷的新鲜组织保存液（MACS®Tissue Storage Solution）中，2-8℃保存，时间不超过48小时。组织大小：取新鲜组织，采用手术刀进行组织修整，切割修剪时不可来回锉动，此外夹取组织时切勿过紧，以免因挤压而使组织、细胞变形。在选择样本前，首先确认好最佳的取材位置及合理的组织大小，保证组织及芯片的有效利用率。组织表面水分去除及含水量高的对应措施：新鲜组织样本取下后迅速用预冷的1×PBS溶液或生理盐水进行冲洗，去除组织表面残留，然后用干净的吸水纸吸干组织表面液体。对于含水量高的组织（眼球、肝、心脏、肌肉、皮肤等），可采用50%蔗糖溶液，4℃脱水15min的脱水步骤后进行再冷冻包埋（不同的样本可采用不同蔗糖处理条件进行脱水）。样本制备流程如下所述。①将干冰处理成粉末状，取一个适当大小的包埋盒，在加入包埋剂和组织之前，对包埋盒进行组织方向的标记。②包埋盒内注入预冷的包埋剂，包埋剂的量要完全覆盖模具底层且不能有气泡；③使用预冷细胞铲，将新鲜组织放入包埋剂中，可适当调整组织的位置，用包埋剂覆盖暴露的组织表面。确认没有气泡，特别是组织附近不能有气泡。④立即将含有组织和包埋剂的包埋盒放在干冰上，完全冻结，将包埋的组织块放入干冰上待切片，或密封保存于-80℃。②取一个适当大小的冷冻包埋盒，在加入包埋剂和组织之前，对包埋盒具进行组织方向的标记。④包埋盒内填充包埋剂，确保组织全部覆盖且组织附近不能有气泡。⑤用镊子将包埋盒放入已用液氮孵育的异戊烷中，但不能完全浸没。⑥包埋剂完全冻结，将包埋的组织块放于干冰上待切片，或密封储存在-80℃中。
①新鲜组织离体后用实验专用吸水纸擦干表面，立即进行固定，组织缺血离体时间控制在1h内。②组织尽量小而薄，便于固定剂迅速渗入组织内部，一般厚度不超过5mm。③将组织固定在10%的中性福尔马林或者4%多聚甲醛中。固定剂应该有足够的量，一般为组织块体积的10-15倍，固定剂需重新配制，不可使用经过长期保存的固定剂。④在室温下固定24-48小时。提醒：固定时间根据组织类型，组织块大小确定。较大组织与小组织相比可能需要更长的固定时间，但最长不超过72小时。①提前将4% PFA（pH 7.4）、30%蔗糖溶液（以PBS稀释）、1× PBS、包埋剂预冷，然后用预冷的1× PBS冲洗组织，去除残留的血液擦干后，将组织转移到含有新鲜制备4% PFA溶液的50 mL离心管中。②可将含有组织的离心管放在振荡器上轻轻振荡，在4°C下固定约12-16小时，直到组织沉入管底。固定时间根据组织类型，组织块大小确定。③12-16小时后，将试管从振荡器上取下，检查组织是否已沉入离心管底部。如果没有，每2-3小时检查一次，持续至24小时（固定不充分，组织形态无法保证、RNA降解；固定过度，组织硬化，RNA降解）。④使用镊子或刮刀，将组织转移到含有预冷1× PBS的50 mL离心管中，室温孵育1分钟，小心弃去PBS，确保组织块停留在试管底部，使用预冷PBS重复洗涤两次以上（洗涤不补充，会导致固定液残留，影响组织形态）。 ⑤将组织转移到含有30%蔗糖溶液的50 mL离心管中，在4°C下孵育至组织沉入管底，约6-12小时。6小时后，检查组织是否沉入管底。如果没有，每2-3小时检查一次，持续至12小时（沉糖保护，加入冷冻保护物质蔗糖以防止组织冻害，并在冷冻情况下避免冰晶产生）。⑥取一个适当大小的包埋盒，标记组织方向，包埋盒内加入预冷的OCT，OCT的量要完全覆盖模具底层且不能有气泡；使用预冷的镊子，将组织放入OCT中，用额外的OCT覆盖表面，确认没有气泡，特别是在组织附近。立即将含有组织和OCT的低温包埋盒完全浸没在粉末状干冰上，等待OCT完全冻结；将OCT包埋组织块密封保存在-80°C中，可长期保存。多组织包埋方法一般不建议多个组织一起包埋。但遇到确实需要进行一起包埋的组织，如体积较小的组织（小鼠卵巢，穿刺样本等），可以选择将多块组织包埋在一起，进而可以实现一个点阵（捕获区域）铺贴多个组织，以提升芯片点阵的利用率。但在包埋时需要注意以下几方面：①多块组织同一水平放置，关注的切面方向要保证一致，以确保切片时多个组织关注的区域在同一个切面内。②多块组织放置时最大面积不超过选择的表达芯片面积（0.5cm×0.5cm；6.5mm×6.5mm；1cm×1cm；11mm×11mm等），组织间距要大于1mm，以保证组织切片不超过点阵大小，同时组织间相互不影响。③同一包埋块中的组织取样方法必须一致，组织类型及组织结构必须为同种（例如肺腺癌），以保证整体的RNA质量能够代表所有组织，及所有组织的透化时间一致，利于后续实验开展。④多个组织包埋方法与单个组织操作相同，包埋时注意以上几点即可。组织形态及RNA完整性决定了样本在空间上的分子图像和位置的最佳特征。在进行空间组学研究之前，需要对样本进行HE染色/IF染色形态及样本RNA完整性评估。组织形态评估即评估细胞的完整性。冰冻样本无论是异戊烷-液氮速冻还是干冰速冻，组织内部都容易形成冰晶，对切片完整性和细胞完整性均有很大的影响。石蜡包埋样本因样本进行了固定、脱水等处理，很好地维持了组织形态。 RNA完整性评估采用RIN值（RNA integrity number）和DV200进行评估。冰冻样本在低温条件下保证了样本中mRNA分子的完整性和免疫活性。而石蜡包埋样本经过甲醛固定，石蜡高温包埋，使mRNA分子不仅与蛋白质和DNA分子产生了交联，同时高温使mRNA分子降解，抗原免疫活性降低。RIN值越大，代表RNA完整性越高，RIN值越小，表示RNA降解的越严重。DV200是指样本RNA中超过200个核苷酸的RNA片段的百分比。该指标评估福尔马林固定样本（FxF、FFPE）的RNA降解程度或完整程度。以下是具体的产品类型对应的样本核酸质量评价标准如下表所示：由于空间多组学中转录组的检测受RNA不稳定影响，对组织的质量控制更加严格。组织制备过程将直接影响组织核酸完整形及组织形态，从而影响空转的开展。特别是目前新推出的10x HD产品，对组织的质量要求更高，组织样本本身性质对于最终表达水平的影响很大，对于低表达潜力的组织区域检出的UMI不高，所以在样本制备时要格外注意，遵循官方的方法建议，优先确保组织形态。一般组织形态良好，对应的核酸完整性也是良好的。 FF组织易产生核酸完整性不足或冰晶影响实验的状况。导致核酸完整性不合格的因素主要包括：②组织存在冻融，如在运输过程中干冰不足、或冰箱温度未稳定，核酸发生降解；③组织本身存在坏死、或取样后较长时间置于室温或4℃，过程中发生降解；⑤组织存在大量冰晶、胞质或胞核发生破裂，核酸易降解。影响组织形态不合格的因素主要包括：①组织缓慢冷冻，组织发生扭曲、大量空腔；②组织存在冻融，如在运输过程中干冰不足、或冰箱温度未稳定，产生胞质冰晶或胞核；③组织离体后过于干燥、或吸水过度，表层组织乃至深层组织发生细胞干燥皱缩，形态变形；④组织类型本身含水量较高，导致大量冰晶产生，如膀胱组织、横纹肌组织类型。FFPE样本经过固定可以保存良好的瞬时组织形态，但是由于其制备及保存的条件，核酸完整程度会受到一定的影响。① 固定：活体组织一旦停止血液循环和物质代谢就会因物质代谢障碍产生一系列的生物化学和组织化学的改变。因此，对离体组织进行及时固定是保证空间信息不丢失的第一步也是最重要的一步。石蜡组织通过福尔马林或者多聚甲醛固定并包埋石蜡后，可长期保存；组织固定时间短，组织无法脱水浸蜡；但固定时间过长，将导致核酸交联严重，影响核酸完整性水平，进而影响空转检出。建议尽量组织离体到投入固定液的时间不要超过30min。小标本固定时间12~24小时，一般不超过48小时，大标本最长不要超过72小时。 ② 脱水：组织需要依次进行脱水、透明、浸蜡形成包埋块，不同样本类型的脱水时间不尽相同，如果组织中残留的水分导致脱水和石蜡浸润不足，在切片时，组织将无法附着在石蜡块上或从石蜡块上脱落，而过度脱水会造成石蜡处理后出现大块破碎、开裂或折叠。③ FFPE年限及保存条件：FFPE保存年限将显著影响其RNA完整性，因为甲醛交联将随着时间延长更加严重，组织产生更强脆性，核酸被释放过程中产生碎裂。建议制备好的FFPE样本若需长时间保存，应选择低温条件（4℃）保存以减少RNA降解，但也不推荐超低温如-80℃保存，这可能导致组织脆性增加无法成片。④ 切片：一般切片厚度为5~10μm。摊片水温一般为37-45℃，温度过高会导致组织切片迅速解离，温度过低会使展片不充分。烘片温度一般设置为55~60℃，促进石蜡与玻片间粘合，水分残留会导致后续切片染色斑驳，切片与玻片贴合不完全导致后期实验出现脱片风险。组织切片制备水平影响检测质量， 在组织贴片制备过程中，尽量充分展开组织，防止组织折叠导致检出信号无法准确对应组织区域形态或特征。
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