单细胞转录组和单细胞ATAC-seq联合分析案例解析

上一期内容为大家阐述了我们能够通过单细胞ATAC-seq实现哪些分析内容(国自然2025|单细胞ATAC-seq能够实现的分析内容都有哪些？)，在实际的科学研究中，单细胞ATAC-seq的数据分析常常需要和单细胞转录组一起进行联合分析，分别从不同的角度解析其潜在的调控机制。那么单细胞转录组结合单细胞ATAC能够实现哪些分析内容呢？二者的结合能够解决哪些科学问题呢？接下来我们将结合实际案例进行详细阐述！

该研究主要通过利用单细胞转录组和单细胞ATAC-seq等测序技术，为我们展示了正常小鼠和去坐骨神经小鼠腓肠肌中染色质可及区域的图谱。结合多组学数据确定了具有细胞类型特异性的顺式调节网络，突出了能介导肌核类型转换的动态调节机制。通过对正常肌肉和去神经萎缩肌肉进行比较，描述了去神经支配后顺式调节网络的重编程情况，同时揭示了启动子/增强子和靶基因之间的相互作用，并提出了转录因子调控的层次结构，并确定了ELK4是与肌肉萎缩相关的关键转录因子，其通过TGF-β1调控肌肉萎缩。这项研究为我们提供了丰富的基因组资源，这对于解码骨骼肌在生理和病理状态下的调节动力学有着至关重要的意义。

这篇用户文章通过对多个组学的数据进行联合分析，整合了snRNA-seq、snATAC- seq、bulk RNA - seq和H3K27ac ChIP - seq 技术，分别从转录组、染色质可及性、整体基因表达和染色质修饰等多维度进行分析，为构建全面的基因调控图谱提供了翔实的数据支撑。下面我们就文中涉及到的联合分析内容进行详细的介绍。

图1 正常骨骼肌的顺式调控元件及其动态表达图谱

1. 细胞类型多样性解析（图1 1a、1b、1c）：通过结合snRNA-seq和snATAC-seq数据，对正常的和去神经小鼠肌肉核进行分析，鉴定出11种细胞类型，包括不同亚型的肌纤维核、成纤维脂肪祖细胞等。并分别展示了snRNA – seq（图 1b）和snATAC - seq 的细胞注释结果（图 1c），两者的结合清楚描绘了正常骨骼肌细胞类型的构成及特征。

2. 细胞类型特异性染色质可及性模式（图 1d）：通过利用Signac R包分析正常肌肉中八种细胞类型的差异ACRs，并获得了6297个差异 ACRs，同时将在正常的肌肉中的ACRs位点及其分布进行可视化（图 1d 左）。同时，热图展示了正常的肌肉样本中不同细胞类型的差异peak分析结果，进一步体现不同细胞类型在染色质可及性上的特异性特征（图 1d 右）。

3. 基因可及性与表达的一致性验证（图 1e）：选取肌纤维（Trim63、Prkag3）、MTJ（Fmod）、肌卫星细胞（Chodl）、成纤维脂肪祖细胞（Scara5）、巨噬细胞（Nrros）和内皮细胞（Tie1）中的代表性基因，通过免疫染色展示其在正常小鼠 GAS 肌肉中的表达和解剖位置，证实基因可及性与表达在细胞类型上的一致性，强调染色质可及性对基因转录调控的重要性。

图1 正常骨骼肌的顺式调控元件及其动态表达图谱

4. 基序富集分析揭示调控因子（图 1f、1g）：通过结合单细胞转录组和单细胞ATAC-seq数据，对差异ACRs 进行基序富集分析，鉴定出579 个与细胞类型特异性相关的基序及对应的 TF（图 1f），如 MA0796.1/TGIF1、MA1641.1/MYF5、MA0841.1/NFE2 等，这些 TF 可能是肌肉细胞身份的关键调控因子。通过分析为我们展示了其中4个TF（TGIF1、MYF5、NFE2、EHF）在不同细胞类型中的特异性结合基序和转录活性（图 1g），转录因子的足迹分析结果则直观呈现 TF 与基序具体的结合情况（图 1g），snRNA-seq和snATAC-seq的整合分析为理解我们对于TF在染色质上的作用机制提供了多角度理论依据。

5. 顺式共可及性网络分析（图 1h）：通过分析预测正常肌肉中的顺式调控染色质相互作用，确定了53,212 个覆盖启动子、远端和基因内区域的顺式调控关系，以网络形式展示不同区域间的相互作用关系（图 1h），揭示了染色质在空间上的功能互作模式。

6. 候选增强子的鉴定与验证（图 1i）：对于增强子的相关分析，研究人员通过以 Myh7、Chodl、Car3 等基因为例，展示了其染色质可及性、H3K27ac的富集情况及peak to gene的共可及性的情况（图 1i），通过分析远端 ACRs 与启动子区域的共可及性及 H3K27ac的标记情况，推断出可能的候选增强子，为深入理解基因调控机制提供关键线索，同时也为后续研究奠定基础。

图2 去神经肌核中的动态染色质可及性和转录因子网络分析

1. 轨迹分析揭示细胞状态转变（图 2a、2b）：通过结合单细胞转录组和单细胞ATAC-seq数据进行联合分析，分别展示了从正常到去神经肌核的拟时序分析结果，直观反映出肌核随去神经过程的动态改变。同时，通过伪时间进展展示了肌核从正常状态向去神经状态逐步转变的时间序列，为后续分析提供了细胞状态变化的时间框架，同时表明肌核在应对去神经刺激时染色质结构发生了显著重塑。

2. ACRs 可及性定量分析（图 2c）: 左边热图详细展示了20,070 个伪时间相关 ACRs 的相对可及性变化，随着伪时间的推移，去神经肌核中 ACRs 的可及性发生明显改变。右图则呈现 ACRs 可及性在伪时间上的平均值变化，进一步量化了染色质可及性的动态过程，揭示了去神经对肌核染色质可及性的广泛影响。

3. 特定基因位点的染色质变化（图 2d）:通过以 Ttr 和 Myog 等基因为例，通过单细胞ATAC数据分析展示了正常和去神经肌核中这些基因位点的染色质可及性及共可及性的变化。在去神经肌肉中，这些基因位点处的染色质可及性增加，同时共可及性链接也发生改变，反映了基因调控区域在去神经过程中的动态重塑，可能影响基因的表达调控。

4. TF 基序活性与表达变化（图 2e）: 通过单细胞转录组数据分析，获得579 个 TF 基序在伪时间上的相对基序活性变化，以及相应 TF 的表达变化。结果显示，不同 TF 在去神经过程中呈现出多样化的动态模式，如 HINFP、NR3C1、MYOG、ELK4 等 TF 的基序活性和表达变化在不同阶段具有不同特征，反映了 TF 在肌核对去神经响应中的复杂调控作用。

5. TF 动态模式分类（图 2f）:结合单细胞ATAC-seq和单细胞转录组数据，根据 TF 在去神经过程中的染色质可及性、基序活性和靶基因活动变化，将 TF 分为三种动态模式：第一种模式为沿过渡路径基序活性降低，如HINFP，其在正常 IIa/x 型肌核中基序富集分数较高，但随去神经时间延长而降低，靶基因活动也证实了这一动态变化；第二种模式是去神经开始时基序活性增加，随后下降，以 NR3C1 为代表，展示了其在去神经早期的激活和后期的抑制过程。最后一种模式为去神经过程中基序活性和其同源 TF 的可及性从头增加，如 MYOG，在去神经14 天后其基序富集持续增加，与同源 TF 基因及预测靶基因的活性变化一致，体现了MYOG 在肌纤维萎缩过程中的潜在调控作用。

图2 去神经肌核中的动态染色质可及性和转录因子网络分析

1. TF 层次结构与调控网络构建（图 2g）: 通过 Single - Cell regulatory Network Inference and Clustering（SCENIC）分析及相关算法计算，确定了125 个重叠的 TF，并根据其输入和输出连接计算层次高度，将 TF 分为三层。构建的基因调控网络展示了 TF 之间以及 TF 与靶基因之间的复杂调控关系，呈现出发散模式，与去神经肌肉中整体 ACRs 增加的现象一致，表明高层级 TF 通过调控更多下游基因和 TF，对基因表达具有放大效应，从而在肌核对去神经的响应中发挥关键调控作用。

2. 靶基因功能注释与调控机制分析（图 2g）:对 TF 调控的靶基因进行 GO 富集分析，发现这些靶基因参与多种生物学过程，如蛋白质降解（泛素连接酶等）、能量代谢、肌肉发育和适应等。其中，一些 TF 与能量代谢基因的表达调控相关，可能作为转录抑制因子在萎缩肌纤维的调控程序中发挥作用，进一步揭示了去神经肌肉中基因调控网络的复杂性和功能多样性。

通过对上述用户文章的内容进行总结，对于单细胞转录组和单细胞ATAC-seq联合分析能够实现的内容主要包括以下几个方面：

细胞状态和功能分析：结合转录组和ATAC数据，研究特定某些细胞类型的功能及其生理或病理过程中的作用。

细胞异质性分析：结合单细胞转录组和ATAC结果，分析获得不同基因的表达情况和染色质可及性变化情况，进一步揭示细胞群体内部的异质性。

细胞分化轨迹：结合转录组和ATAC的拟时序分析结果，可以追踪细胞从一种状态到另一种状态的分化过程。

转录调控网络：通过联合分析构建基因调控网络，理解基因表达的调控机制。

转录因子结合位点预测：利用单细胞ATAC-seq数据预测转录因子的结合位点，并通过转录组数据验证其功能。

染色质可及性动态分析：分析染色质可及性的变化，揭示细胞状态变化的表观遗传基础。

单细胞转录组和单细胞ATAC-seq的相关性分析：分析两个组学之间细胞类型注释结果的关联性。

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