国自然2025没思路？组蛋白乳酸化CUT&Tag考虑下!

乳酸是瓦尔堡效应期间产生的一种化合物，被广泛认为是能量来源和代谢副产品。正常细胞通过糖酵解、线粒体氧化磷酸化和磷酸戊糖途径代谢葡萄糖。在有氧条件下，糖酵解产生的丙酮酸通过氧化磷酸化产生二氧化碳和氧气。在缺氧条件下，葡萄糖可以通过糖酵解分解代谢成两个丙酮酸分子，同时产生两个三磷酸腺苷（ATP）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）分子。在糖酵解过程中，NADH和丙酮酸被还原为乳酸然后排泄，最后，每个葡萄糖分子在不消耗氧气的情况下产生两个ATP分子和两个乳酸分子。

组蛋白乳酸化修饰是2019年新发现的，一经发表就登上了Nature^[1]，该研究将细胞代谢与表观遗传调控联系起来了。

用LC/MS或LC-MS/MS检测赖氨酸肽段是否有乳酸基团的特征峰，这是经典方法，也是最早用于鉴定Kla修饰的方法。这个方法的优点是精准全面。不但能鉴定是否有Kla修饰，还能通过读谱确定修饰的具体位点，特别适合开创性高的课题。

乳酸化修饰的抗体已经很成熟，有检测全部乳酸化修饰的（pan-Kla)，也有检测特异性位点乳酸化修饰的抗体，例如anti-H3K18la, anti-H3K27la,H4K12la等。根据实验的精细程度，可以选择免疫斑点实验（左图）和WB实验（右图）。相比其它检测方法，这个方法步骤相对简单，对样本制备的要求相对低，特别适合需要考虑剂量效应和时间效应的课题。

在免疫斑点实验的基础上，也可以用免疫组化或免疫荧光检测样本中乳酸化修饰。与免疫斑点实验和WB相比，这个办法更直观，图片更美观，还能提供乳酸化修饰在细胞器中的定位，特别适合研究对象是复杂组织或者有单细胞测序预算的课题。

ChIP-seq（染色质免疫沉淀测序）和CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）是两种用于研究蛋白质-DNA相互作用和组蛋白修饰的高通量测序技术。

ChIP-seq技术是使用甲醛交联方法将样本中所有蛋白质与其结合的DNA固定下来。然后裂解细胞并通过超声处理将DNA打断成小片段（约300bp）。之后进行免疫共沉淀，即利用目标蛋白对应的抗体吸附我们想要的片段，形成抗体-蛋白-DNA复合物，并洗脱不想要的部分。下一步就是目标片段富集，将抗体与特定的标签（如Protein A/G）结合，通过磁珠等方法将目标片段富集起来。最后结合NGS对富集后的片段进行测序，分析其在全基因组中的分布特征。

CUT&Tag技术首先对细胞膜进行通透处理，通过洋地黄皂苷等试剂使细胞膜和核膜透化，使得特异性抗体能够进入细胞核与目标蛋白结合。然后将一抗与二抗结合，一抗进入细胞后，与二抗结合，实现信号放大。之后进行pAG酶激活，将适当的pAG酶与抗体结合，并在激活时在抗体结合处任一侧结合DNA，导致染色质在目标区域被切割。接着Protein A蛋白与Tn5转座酶的融合蛋白（ChiTag）直接结合抗体，连带的Tn5转座酶将切割目的蛋白，从而标记目标区域。最后对标记后的片段进行高通量测序，分析其在全基因组中的分布特征。

其中，CUT&Tag又由于其比较明显的技术优势而被广泛应用。

联川生物拥有丰富的ChIP-seq和CUT&Tag项目经验（乙酰化、甲基化、乳酸化、磷酸化等），只要有对应的组蛋白修饰抗体，联川生物均能完成。

组蛋白乳酸化目前文章数量相对较少，但作为新兴组蛋白修饰，很可能成为下一个肿瘤研究领域的热点。考虑到Warburg效应（好氧糖酵解）是癌症的标志之一：即使在有氧条件下，癌细胞也倾向于使用葡萄糖发酵成乳酸盐来产生能量。那么组蛋白乳酸化对肿瘤发生过程有如何影响？下面向大家分享几篇经典案例。

这篇文章是2022年11月，来自哈尔滨医科大学第二附属医院团队在Circulation research上发表原创文章“Histone Lactylation Boosts Reparative Gene Activation Post-Myocardial Infarction”，借助CUT&Tag技术，揭示了组蛋白乳酸化修饰通过促进修复基因转录调节单核巨噬细胞抗炎和促血管生成双重活性，从而有利于心梗后修复环境并改善心梗后心脏功能的重要作用。详细内容可点击：Circ Res：单细胞+CUT&Tag揭示组蛋白乳酸化促进心梗修复

首先，作者利用CUT&Tag技术结合RNA测序分析，精确地鉴定了组蛋白H3K18乳酸化（H3K18la）的靶基因，包括Lrg1、Vegf-a和IL-10。这些基因在MI后心脏修复中起到至关重要的作用，它们的表达和H3K18la修饰水平在MI后显著增加。研究发现，组蛋白乳酸化通过促进这些修复基因的转录，调节了单核-巨噬细胞的抗炎和促血管生成的双重活性，这对于心肌梗死后心脏功能的恢复和修复至关重要。此外，研究还探讨了MI后早期单核细胞的代谢重编程，发现失调的糖酵解和MCT1（单羧酸转运蛋白1）介导的乳酸运输促进了组蛋白乳酸化。研究进一步揭示了IL-1β（白介素-1β）依赖的GCN5（一般控制非压抑性5）招募对H3K18la的催化作用，以及其在调控单核细胞组蛋白乳酸化和下游修复基因表达中的潜在上游调控元件的角色。这些发现不仅增进了我们对MI后内源性保护机制的理解，而且为改善心脏修复提供了新的线索和机制基础。

研究模式图

2024年6月25日，重庆医科大学侯胜平及首都医科大学李纳共同通讯在Genome Biology 在线发表题为“A feedback loop driven by H3K9 lactylation and HDAC2 in endothelial cells regulates VEGF-induced angiogenesis”的研究论文，该研究发现内皮细胞中H3K9乳酸化（H3K9la）和组蛋白去乙酰化酶2（HDAC2）之间的反馈回路驱动VEGF诱导的血管生成。详细内容可点击：Genome Biol：组蛋白乳酸化H3K9la调控VEGF诱导的血管生成

这篇文章采取了多角度的研究策略来深入探究血管内皮生长因子（VEGF）如何通过影响组蛋白乳酸化，特别是H3K9乳酸化（H3K9la），以及与组蛋白去乙酰化酶2（HDAC2）的相互作用来调控血管生成。研究者们首先观察到VEGF刺激下内皮细胞中H3K9la水平显著上调，并利用CUT&Tag技术，这是一种用于研究蛋白质-DNA相互作用的基因组范围方法，来识别H3K9la在内皮细胞中的潜在靶基因。通过深度分析，研究者们发现H3K9la在与血管生成相关的基因启动子区域显著富集，特别是那些参与细胞增殖、迁移和粘附的基因，如NECTIN1、TGFBR2、ABL1、PTGFR、LAMA4、CLASP2、PRCP和EGFR。这些基因的表达水平在VEGF刺激下显著上调，表明H3K9la通过促进这些基因的转录来参与血管生成。

进一步的机制研究表明，H3K9la的过度乳酸化抑制了HDAC2的表达，而HDAC2是已知的乳酸化擦除酶。研究者们提出了一个反馈回路模型，即VEGF刺激增加H3K9乳酸化，进而抑制HDAC2的表达；HDAC2表达的降低反过来又促进H3K9乳酸化，并提高H3K9la靶基因的表达，从而推动血管生成。为了验证这一模型，研究者们在VEGF刺激的内皮细胞中过表达了HDAC2，发现这导致H3K9la水平显著下降，并且血管生成相关基因的表达水平降低，内皮细胞的血管生成能力受到抑制。

研究模式图

综上所述，这项研究详细描绘了VEGF通过H3K9la和HDAC2之间的相互作用调控血管生成的分子机制，并提出了通过打断H3K9la/HDAC2反馈回路来治疗病理性新生血管生成的新策略。这些发现不仅增进了我们对血管生成调控机制的理解，而且为开发新的治疗策略提供了潜在的靶点。

这两篇文章均运用到CUT&Tag技术，分别揭示了组蛋白乳酸化H3K9la在心梗修复中的促进机制，以及组蛋白乳酸化H3K9la在VEGF诱导的血管生成中的调控机制，为疾病治疗提供了潜在的治疗靶点和重要的参考价值。同时，也让我们看到了相较于传统的ChIP-seq，CUT&Tag技术存在的绝对优势和应用潜力。

CUT&Tag作为进阶版研究DNA与蛋白质互作的测序技术，完全颠覆传统ChIP-seq的操作流程，能够高效、准确地检测细胞中的蛋白质与DNA之间的相互作用。联川生物拥有丰富的CUT&Tag项目经验（乙酰化、甲基化、乳酸化、磷酸化等），只要有对应的组蛋白修饰抗体，联川生物均能完成。

参考文献：

[1] Wang N, Wang W, Wang X, et al. Histone Lactylation Boosts Reparative Gene Activation Post-Myocardial Infarction. Circ Res. 2022;131(11):893-908.

[2] Fan W, Zeng S, Wang X, et al. A feedback loop driven by H3K9 lactylation and HDAC2 in endothelial cells regulates VEGF-induced angiogenesis. Genome Biol. 2024;25(1):165. Published 2024 Jun 25.

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