2025年，国自然申请即将拉开序幕。你是否苦于找不到研究方向抓头挠腮？国自然还有哪些新的研究热点？“天之骄子”的单细胞和空间组学测序技术面临哪些挑战？医院中海量的FFPE（Formalin Fixation and Paraffin Embedding）样本库能开展单细胞和空间组学研究吗？FFPE单细胞和空间组学技术是否能成功助力申请国自然？
单细胞空间组学测序技术从问世起，就受到了科学界和产业界的极大关注，该技术在描述样本中细胞图谱和组织结构信息具有独特的优势，能够高通量、快速地拿到每个细胞和每个细小区域内的基因表达信息。单细胞和空间转录组测序技术已经成为探究复杂组织中细胞类型、分子变化和细胞功能的重要手段，已广泛应用于临床医药和动植物领域的研究。
然而，单细胞和空间转录组技术依然面临诸多挑战，其中最大的困境是，目前绝大部分高通量单细胞和空间转录组测序平台对待测样本的细胞活性和RNA质量的要求较高，但临床的大部分样本为冻存或福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）处理的组织，细胞活性极低，RNA质量较差，很难利用现有的单细胞和空间转录组技术进行有效检测。
尽管FFPE保存样本对生命科学研究来说是革命性的，但这种处理方式会破坏DNA/ RNA分子，基本上会出现严重的降解情况。甲醛固定和组织包埋实验会降解FFPE组织中的RNA，形成高度碎片化的低完整性的RNA分子，通常RNA完整性指数（RIN）<2.5。这让转录组层面的依赖于逆转录扩增的常规实验方法很难有效捕获到多数转录本片段。另外有研究表明，FFPE保存的样本，随着保存年限的增加，其可研究的核酸有效利用率越低。石蜡块存储4-6年后，荧光法测定的DNA量减少到47%，而且只有11%的DNA是可扩增的。FFPE样本核酸保留度和核酸完整性的限制成为阻碍科研及临床研究者进一步探索这类样本中蕴含的宝贵信息，使得FFPE样本无法最大程度发挥自身的价值，从而沦为沉睡的“宝藏”。
目前主流的空间转录组的最小捕获面积（即分辨率）还达不到单细胞水平。这会导致给定位置捕获的转录本可能来自一组异质细胞，即任何位置观察到的表达谱都可以且应该被认为是多个不同来源的转录本的混合物。这使空间转录组学技术处于两难境地，即知道转录本的位置，但不知道产生转录本的细胞。相反，单细胞转录组可将每个转录本与单个细胞关联起来，但对应的细胞内所检测到的转录本在组织内的位置信息却丢失了。鉴于两种组学技术在研究细胞类型及空间分布方面具有互补的特点，因此，有学者就提出是否可以将两种技术的数据进行联合来全面地展示所研究组织中的细胞类型及其空间分布状态。
通过整合单细胞和空间转录组数据，可以更准确地理解细胞类型分布的结构，以及构成这种结构的细胞间通讯的假定机制。这种整合的方法可以在空间上绘制发育和疾病中的特定细胞亚群，并阐明这些细胞亚群协同形成组织表型的机制。
在理解了Flex和空转联合分析的必要性后，我们来看一下联合分析的具体流程：
在通过10x官方Cellranger和Spaceranger的流程获得基因表达矩阵后，分别对FFPE单细胞数据和空间转录组数据用Seurat进行进一步的过滤及分群。同时对FFPE单细胞结果进行细胞类型的鉴定。鉴定完成后，基于细胞鉴定的结果将细胞注释进行反卷积，映射到空间转录组数据上。后续的分析与单细胞转录组分析类似，对感兴趣区域数据进行下游分析、使用CellChat、CellphoneDB，stlearn等软件进行细胞通讯分析和拟时序分析。空间转录组数据建议使用Loupe Browser进行分析结果的可视化，比如查看关注细胞类型的空间分布和共表达情况，组间的差异基因，也可以重新设定过滤阈值将数据重新过滤等。
样本类型：乳腺癌
刊登日期：2023
发表期刊：Nature Communication
所用技术：FFPE空间转录组，Flex，Xenium
实验设计和技术应用
对1例乳腺癌FFPE样本进行连续切片。使用三种兼容FFPE样本的技术进行测序：单细胞基因表达Flex、空间转录组和空间原位，并进行联合分析以绘制高分辨率的乳腺癌FFPE样本肿瘤微环境图谱。
主要研究结果
通过无监督聚类的方式在Flex数据中生成了17个cluster，每个细胞的基因中位数位1480。通过收集与scFFPE-seq相邻的5um组织切片，生成了Visium数据 Flex和Visium使用了相同的探针组（由54,018个探针靶向的18,536个基因），从而更易于下游分析的数据整合。Visium数据的同样降维产生了17个cluster（与Flex数据的cluster数相同），每个spot的基因中位数为5712。
使用两个先验的人类乳腺癌数据集来注释Flex数据中的17个cluster（图a），并将细胞注释结果映射到Visium数据中（图b，c）。在Visium数据中，17个cluster中有10个cluster被分配了唯一的细胞类型/疾病状态，剩余七个cluster都有混合的细胞组分，且确定了三个由Flex数据识别到的肿瘤相关cluster在空间上的位置情况，包括两种不同原位导管癌（DCIS #1和DCIS #2）和侵袭性肿瘤。并且Visium数据还指出了免疫细胞和基质细胞的大致区域，并能够从脂肪细胞中重新获取转录本。
Flex和Visium FFPE可以分别在单细胞分辨率和空间角度提供分析角度，共同揭示了两种不同的 DCIS 和肌上皮细胞类型，两者结合提高了对肿瘤微环境中细胞类型和分子异质性的理解。
样本类型：结直肠癌
刊登日期：2023
发表期刊：Cell
所用技术：FFPE空间转录组，Flex，MxIF
实验设计和技术应用
本研究的样本包括31个来自人类结直肠标本，其中包括MSS（n = 12）、MSI - H（n = 10）CRC 以及癌前肿瘤亚型（n = 8，包括 4 个 SSL/HP 和 4 个 TA/TVA）
主要研究结果
该研究通过整合31例人类结直肠癌样本的空间多组学数据，揭示了从癌前病变到恶性肿瘤的动态细胞及遗传异质性。研究人员对FFPE标本进行连续组织切片，切片分别用于多重免疫荧光（MxIF）分析、Visium FFPE空间转录组和单细胞FFPE。
MxIF提供亚细胞分辨率的全片蛋白表达；Visium FFPE在空间分辨率下捕获mRNA转录本；单细胞FFPE为细胞类型组成提供参考。本研究通过利用单细胞数据，采用非负矩阵分解（NMF）方法构建了包含30种不同细胞状态的参考集，涵盖了正常黏膜细胞、肿瘤特异性状态和浸润免疫细胞等，并分析其相关基因和通路富集。使用上述构建的参考集从Visium FFPE表达矩阵中提取细胞状态，计算细胞状态在每个spot中的比例，即解卷积得到细胞状态分数，该打分结果与MxIF细胞类型标记表达及文献中的细胞类型和细胞活性基因特征相关。本研究进一步基于打分结果对组织区域进行划分和特征分析，根据细胞状态组成将组织划分为八个区域，并在其中识别出不同肿瘤类型中富集的上皮细胞状态，如CIN +上皮、正常黏膜和无蒂锯齿状上皮等，这些区域与组织学特征在空间上对齐。本文通过对Visium FFPE图谱数据中的基因表达情况，确定了与 CIN + 肿瘤免疫排除相关的基因（DDR1、TGFBI、PAK4 和 DPEP1），这些基因形成的免疫排除签名（IEX）与 CIN + 肿瘤进展相关，且与细胞外基质信号和组织调节功能相关。在FFPE单细胞数据中，发现IEX 在癌特异性上皮细胞中高表达，且与 CD8 + T 细胞浸润负相关，T 细胞呈现休眠和耗竭状态。研究还发现了一个由DDR1、TGFBI、PAK4和DPEP1组成的免疫排斥特征（IEX），该特征与CIN+肿瘤进展相关，且与细胞毒性细胞浸润减少有关。
本文绘制了揭示散发性结直肠肿瘤的单细胞和空间转录组图谱，采用多模态空间组学技术进行结直肠肿瘤的进化和微环境动态变化研究。
[1] Heiser, Cody N., et al. “Molecular cartography uncovers evolutionary and microenvironmental dynamics in sporadic colorectal tumors.” Cell, vol. 186, no. 25, Dec. 2023, https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.11.006.
[2] Janesick, Amanda et al. “High resolution mapping of the tumor microenvironment using integrated single-cell, spatial and in situ analysis.” Nature communications vol. 14,1 8353. 19 Dec. 2023, doi:10.1038/s41467-023-43458-x
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