好的国自然申请，除了严谨的设计思路，扎实的科研功底之外，前沿技术也可以为国自然申请增色不少。2023年，空间多组学技术荣登年度技术，长期登顶各大顶刊！自空间转录组技术问世以来，其飞速发展，炙手可热，被称为探究组织精细结构的“高分辨显微镜”。
组织样本（临床及动植物）是一个高度复杂的生物系统，由高达数百亿个细胞做成，这些细胞由相同的遗传物质开始，发育成特定的细胞，且随着生物体的不断生长发育形成不同的组织和器官[1]。即使是在发育结束之后，不同细胞的空间位置排布，同样也会影响该细胞的分化方向以及生物学功能，同样不同细胞的空间分布状况同样也会影响其他细胞接受信号的状态[2]。而这种细胞间行使通讯功能的信号因子，往往是介导某一疾病的关键性调节因子，甚至可以通过靶向该信号因子达到调控或者是治疗某一疾病的作用[3]。上述均表明如果想要构建全面且精细的多细胞网络图谱，全面解析生物体发育，疾病的发生机制及治疗效果等，单细胞和空间组学技术的发展尤为重要[4-8]。
转录组技术发展史上主要经历的三个重要的阶段，其方法的革新促使其研究场景从组织、细胞簇、单细胞、含有空间信息的单细胞依次递进。2020年，空间转录组被《Nature Methods》杂志评为年度技术；2022年空间多组学被Nature杂志称为最值得期待的技术之一；2023年，空间多组学再次被追誉为未来最值得期待与关注的方法。根据获取细胞在组织中不同空间位置信息的方式，空间转录组技术主要可分为基于显微切割、原位杂交、原位测序和原位捕获等技术类型[1-4]。本文整理了目前联川生物全生态单细胞空间转录组平台上所包含的主流空间转录组技术平台，针对其技术原理、优势、适用的样本类型以及如何结合自己样本的实际情况选择合适的方法进行空间组学研究等方面进行了阐述。
备注：FFPE（石蜡包埋的组织）；FxF（多聚甲醛固定OCT包埋组织）；FF（新鲜组织OCT包埋）
具体操作流程可参考
“https://mp.weixin.qq.com/s/fZFVAjKplttwtxNnzVph8w”
以及可参考
“联川生物视频号发布的相关空转组织包埋视频”
一步一图解教你如何进行空间转录组样本制备
10x Genomics空间转录组测序平台
技术概述
Visium空间转录组测序基于PolyA尾捕获的原理进行，依托于基因表达芯片和组织透化芯片，每个基因表达芯片包含四个捕获区域，大小为6.5mm x 6.5mm，5000个spots，spots大小为55μm，数百万条引物（引物结构：poly（dT）+UMI+Barcode）。
适用样本类型
Ø 所有有参考基因组的新鲜组织样本（RIN>7）；
Ø 关注的基因不在CytAssist panel list中；
参考“什么样的组织样本可以开展10x Visium空间转录组研究？”
什么样的组织样本可以开展10x Visium空间转录组研究？
实验流程
1、样本准备：对FF组织进行RNA质量以及组织形态学质检
ü RIN大于7
ü 形态结构完整无断裂
2、预透化实验：将FF组织切片放置在Visium预透化玻片（8个捕获区域）上，并进行荧光成像，确定最佳的透化时间点；
3、线上选片：组织切片通过H&E染色，使用显微镜对切片进行组织成像，结合成像结果选择组织形态结构满足病理需求的组织切片进行正式实验；
4、组织透化及文库构建：对选定的组织切片进行透化处理，以释放带有polyA的RNA，使其与玻片上的捕获探针（UMI和Barcode）杂交，从而实现基因表达信息的捕获，并制备测序文库；
5、数据可视化：通过特有的分析软件将空间层面的基因表达结果和形态学的结果结合在一起，进行可视化展示；
Visium工作流程
技术优势
Ø 适用物种丰富：适用于全物种的空间转录组测序技术；
Ø 全转录组的信息：采用PolyA捕获方式进行的实验，理论上所有带有的PolyA的RNA均会捕获到；
Visium CytAssist空间转录组测序基于探针对捕获的原理进行，依托于常规免疫组化玻片（世泰免疫组化玻片/高粘附性玻片Sigma）和基因表达芯片，每个基因表达芯片包含2个捕获区域，大小为6.5mm x 6.5mm/11mm x 11mm，5000/14000个spots，spots大小为55μm，引物结构如上。
适用样本类型
Ø 人和小鼠石蜡样本/甲醛（多聚甲醛）固定样本/新鲜组织；
Ø 降解的样本（DV200≥30%；RIN>4）；
Ø 关注的组织区域较大（两种芯片规格随心选择）；
Ø 容易脱片的组织样本；
CytAssist让冰冻样本的空间转录组数据更优秀
实验流程
1、样本准备：对FFPE/FxF/FF组织进行RNA质量以及组织形态学质检
ü FFPE样本DV200 ≥30%；
ü FF样本RIN ≥ 4
ü FxF样本DV200 ≥50%；
ü 组织形态完整无冰晶；
2、线上选片：将FFPE/FxF/FF组织切片放置在常规免疫组化玻片上，并进行组织学成像（通过H&E/IF染色获得形态背景）；
3、探针杂交：Visium FFPE 玻片上的每个捕获区都有一个阵列，其中含有与RNA结合的捕获探针（RTL）。RTL有两段组成分别是LHS（左端探针）和RHS（右端探针）。左端探针有read 2结构，右端探针有polyA结构。探针杂交后，mRNA的两段连续探针只有同时被杂交之后才会进行连接，若只有其中一段被捕获，则无法进行建库，显著降低假阳性结果，RTL探针组确保了高特异性和高灵敏度；
左端探针 (LHS）：Read 2S（提供扩增引物的结合位点） + 与mRNA互补配对序列
右端探针 (RHS）：PolyA（与捕获序列的poly(dT)结合） + 与mRNA互补配对的序列
4、组织透化及文库构建：对组织进行透化处理（CytAssist仪器内），以释放连接的探针对，使其与玻片上的捕获探针（UMI和Barcode）杂交，从而实现基因表达信息的捕获，从而制备测序文库；
5、数据可视化：通过特有的分析软件将空间层面的基因表达结果和形态学的结果结合在一起，进行可视化展示；
Visium CytAssist工作流程
技术优势
Ø 简便的样本处理：将转录组和蛋白质组分析物从标准载玻片自动转移到Visium玻片的捕获区域，简化样本处理；
Ø 人为干扰大大降低：无需在Visium玻片上直接贴片，将样本兼容性扩展到贴有切片的载玻片；
Ø 极短周期：使用CytAssist专用玻片和试剂，每次运行可从最多两张FFPE组织切片中精确捕获分析物，而时间不到一小时；
Ø 样本兼容性极高：DV200的质控要求降为>30%，允许检测更多长期保存的高度降解的样本，样本兼容性更高；
Ø 大区域捕获：新增加了大面积11mm * 11mm捕获区域，捕获面积更大，可能性更多；
Ø 高质量的空转数据：三对探针对捕获，基因检出效率大大增加；
Ø 疑难样本的解决方案：更高的组织粘附性，无需进行复杂的预实验。
Visium HD空间转录组测序基于探针对捕获的原理进行，依托于常规免疫组化玻片（世泰免疫组化玻片/高粘附性玻片Sigma）和最新的HD基因表达芯片，每个基因表达芯片包含2个捕获区域，大小为6.5mm x 6.5mm，spots大小为2μm，分辨率极高，引物结构如上。
适用样本类型
Ø 人和小鼠石蜡样本/甲醛（多聚甲醛）固定样本/新鲜组织；
Ø 需要高分辨率的空间组学研究；
Ø 研究微小组织区域的空间结构特征；
参考“单细胞分辨率的空间转录组测序---Visium HD全球发布”
单细胞分辨率的空间转录组测序---Visium HD全球发布
实验流程
1、样本准备：对FFPE/FxF/FF组织进行RNA质量以及组织形态学质检
ü FFPE样本DV200大于＞30%；
ü FF样本RIN≥4；
ü FxF样本DV200≥50%；
ü 组织形态完整无冰晶；
2、线上选片：将FFPE/FxF/FF组织切片放置在常规免疫组化玻片上，并进行组织学成像（通过H&E染色获得形态背景）；
3、探针杂交：Visium FFPE 玻片上的每个捕获区都有一个阵列，其中含有与RNA结合的捕获探针（RTL）。RTL有两段组成分别是LHS（左端探针）和RHS（右端探针）。左端探针有read 2结构，右端探针有polyA结构。探针杂交后，mRNA的两段连续探针只有同时被杂交之后才会进行连接，若只有其中一段被捕获，则无法进行建库，显著降低假阳性结果，RTL探针组确保了高特异性和高灵敏度；
左端探针 (LHS）：Read 2S（提供扩增引物的结合位点） + 与mRNA互补配对序列
右端探针 (RHS）：PolyA（与捕获序列的poly(dT)结合） + 与mRNA互补配对的序列
4、组织透化及文库构建：对组织进行透化处理（CytAssist仪器内），以释放连接的探针对，使其与玻片上的捕获探针（UMI和Barcode）杂交，从而实现基因表达信息的捕获，从而制备测序文库；
5、数据可视化：通过特有的分析软件将空间层面的基因表达结果和形态学的结果结合在一起，进行可视化展示；
技术优势
Ø 单细胞分辨率：HD基因表达芯片spots结构为2 x 2 µm带条形码标签的方格，以单细胞分辨率对组织进行组织结构分析，探索微小区域的空间结构特征；
Ø 全组织覆盖：通过连续排列有寡核苷酸的捕获区域带条形码标签的方格组织，内部无缝隙，全组织覆盖度，探索未知区域/被隐藏组织区域特征；
Ø 高质量的空间数据：采用CytAssist平台，提供更高质量且更精准的转录本定位，探索复杂组织的空间结构特征；
Xenium原位分析技术基于探针对捕获的原理进行，Xenium原位分析使用针对目标转录本的可循环探针，然后进行酶扩增，以创建荧光探针杂交的靶标。在Xenium分析仪上，组织的显微镜图像检测每个荧光探针的位置，然后将其移除。连续几轮的荧光探针杂交、成像和去除创建了一个独特的光学特征，揭示了在一个组织中每个细胞内一个位置上的RNA的信息。该分析仪依托于其本身的Xenium芯片，每个基因表达芯片包含1个捕获区域，大小为12mm x 24mm，真正单细胞分辨率的空间分析技术。
适用样本类型
Ø 石蜡和新鲜组织样本；
Ø 追求单细胞分辨率的空间组学研究；
Ø 研究的组织区域较大；
Ø 关注的基因明确；
Ø 需要对单细胞或者空间转录组数据进行验证的研究；
Xenium Explorer：数据挖掘的利器
实验流程
1、样本准备：对FFPE/FF组织进行RNA质量以及组织形态学质检
ü FFPE样本DV200大于30%；
ü 组织形态完整无冰晶；
2、线上选片：将FFPE组织切片放置在常规玻片上，并进行组织学成像（通过H&E/IF染色获得形态背景）；
3、滚环扩增：将5μm的正式组织切片放置在Xenium载玻片上，并利用特异性DNA探针杂交靶向到mRNA上，进行滚环扩增（RCA，Rolling circle amplification）。
4、循环成像和解码：将Xenium载玻片放置到Xenium Analyzer仪器中进行荧光探针杂交（使用特定的携带荧光的探针对滚环复制后的target进行多轮检测）、循环成像、解码和数据分析，从而解析空间层面亚细胞的转录组图谱。
技术优势
Ø 样本类型兼容性强，Xenium技术流程可以兼容FF和FFPE组织，满足临床及科研样本的检测分析需求；
Ø 检测通量更大，Xenium载玻片的成像区域大小为12mm x 24mm，一次可同时检测两张玻片上机，满足横截面较大的组织研究需求；
Ø 组织原位的亚细胞分辨率，独特的探针设计，增强了检测的灵敏性和特异性，结合原位显微成像的检测方法，保留RNA分子的原位特征，可以实现亚细胞的分辨率，精准识别罕见生物学特征；
Ø 灵活定制Panel组合，在官方推出的商品化Panel基础之上，可灵活增加个性化定制目标基因（可增加1~100个基因）。
Ø 高灵敏性、高特异型探针，平均每个基因设计8对探针，根据表达量高低调整探针数量；环形探针扩增后增加信号强度，便于成像分析处理；
Ø 无需NGS测序，根据每个基因特异性的荧光特征条码，实现目标基因的定位和识别；
Stereo-seq时空转录组测序基于DNB纳米球（PolyA）捕获的原理进行，依托于预透化芯片和时空基因表达芯片，每个基因表达芯片包含1个捕获区域，芯片大小包含0.5cm x 0.5cm/1cm x 1cm/1cm x 2cm/2cm x 2cm/2cm x 3cm，此外还包含13cm x 13cm 等可定制，适用于大组织的芯片，DNB纳米球大小为220nm，亚细胞分辨率，引物结构如下：
适用样本类型
Ø 新鲜组织样本（RIN>7）；
Ø 关注的区域较大（多种芯片规格随心选择）；
Ø 研究微小组织空间结构特征；
Ø 需要高分辨的空间组学研究；
真的细！难怪发多篇CNS！
实验流程
1、样本准备：对FF组织进行RNA质量以及组织形态学质检
ü RIN大于7；
ü 形态结构完整无断裂；
2、预透化实验：将FF组织切片放置在时空预透化玻片（4个捕获区域）上，并进行荧光成像，确定最佳的透化时间点；
3、线上选片：组织切片通过H&E染色，使用显微镜对切片进行组织成像，结合成像结果选择组织形态结构满足病理需求的组织切片进行正式实验；
4、组织透化及文库构建：对选定的组织切片进行透化处理，时空芯片上布满了空间捕获探针，能与组织细胞释放出的RNA分子结合，从而使其与玻片上的捕获探针（CID和MID）杂交，从而实现基因表达信息的捕获，并制备测序文库；
5、数据可视化：通过StereoMap分析软件将空间层面的基因表达结果和形态学的结果结合在一起，进行可视化展示；
技术优势
Ø 纳米级分辨率：Stereo-seq具备纳米级分辨率，理论上可实现100%的细胞捕获率，可以得到更多细胞信息和精准的细胞聚类结果；
Ø 大视野：Stereo-seq芯片最大可以达到13cm x 13cm的超大视野，实现器官和生命全景分子细胞图谱的绘制；
Ø Cell bin实现空间单细胞水平分析：Stereo-seq通过图像识别细胞核的位置，结合算法可实现近似单细胞水平的表达图谱；
目前基六大主流空间转录组技术而言，所对应的芯片规格也有不同，其中Visium HD/CytAssist/Visium的捕获区域的大小均为6.5mm*6.5mm，但Visium HD/CytAssist芯片中仅有两个独立的捕获区域，可同时上机两个样本；而Visium芯片中有四个独立的捕获区域，可同时上机四个样本；而Xenium的芯片捕获区域为12mm*24mm，实际可贴片的区域为10.45mm*22.45mm；华大时空转录组的芯片捕获区域可以基于实际的组织大小来选择更具备个性化，常用的芯片规格的捕获区域大小且1cm*1cm，芯片上仅有一个独立的捕获区域，可同时上机一个样本。
基于以上，对于面积相对较大的样本或者多样本同张玻片检测，Xenium和华大时空转录组有特殊优势。
Visium HD芯片规格
Xenium芯片规格
华大时空转录组芯片规格
目前时空转录组兼容的样本类型十分丰富，可结合样本的实际特征以及制备的难易程度选择合适的产品。其中六大主流空间转录组技术平台中，仅适用于新鲜组织OCT包埋样本的技术平台为Visium/华大时空转录组，且除人和小鼠样本之外其他物种的样本也可以采用上述两种技术开展时空转录组实验；石蜡样本和OCT样本均适用的产品为Visium HD/CytAssist/Xenium，后期可以基于对分辨率的要求以及研究目的选择合适的产品开展实验。其中Visium HD/Xenium的分辨率极高，其表达将体现组织真实生理病理状态，所以对于组织形态的要求极高，当组织结构中出现大面积的坏死、纤维化、钙化以及由血液残留时均会影响基因检出。此外由于Xenium是基于荧光成像的方案检出基因的，故当样本中本身存在自发荧光时，尤其是存在较强的自发荧光时，也会对本身基因检出的探针的荧光信号造成干扰，导致结果的不准确。
备注：FFPE（石蜡包埋的组织）；FxF（多聚甲醛固定OCT包埋组织）；FF（新鲜组织OCT包埋）
目前对于时空转录组而言，大多是芯片上铺满了各种spots，spots中存在上百万种的引物序列用来捕获mRNA，因此对于时空转录组数据分析来说，就存在细胞分割的问题？
目前常见的时空转录组的细胞分割方案主要有两种，如下所示
ü 借助细胞分割技术：如细胞核、细胞质或细胞膜染色，依靠监督机器学习训练数据来预测细胞的边界，以华大时空转录组/Xenium V1版本为主，其中Visium HD也可以采用该方法进行分析（借助第三方分析软件包）；
ü 空间索引转录组方法，细胞组成是通过对每个像素的基因表达使用去卷积算法来推断的（反卷积模型通常需要每种细胞类型的表达谱，可以从相同或类似组织的单细胞测序的数据中获得）
从上述方案中，首先我们不难看出，对于时空转录组而言如果想要解析出每个spots中包含哪些细胞类型的话，单细胞的数据必不可少，尤其是针对于低分辨率的时空转录组（Visium/CytAssist）而言；其次就算是基于上述两种方案也很难实现真的空间层面上的单细胞分辨率，如果想要分析出每个细胞内的基因表达情况的空间结构解析的话，目前的方案是直接将细胞膜染出来再对应检测每个细胞膜内的基因表达，即Xenium。Xenium基于其多模态染色试剂盒将细胞膜、细胞内容物以及细胞核等染料的组合，实现真正单细胞分辨率的空间结构解析。
基于以上，目前时空转录组技术百花齐放，每种时空转录组技术都有其对应的优势，故实际在选择合适的时空转录组产品时，可结合物种信息、样本信息（包埋方式/组织特性等）、对于分辨率的要求以及研究目的来选择合适的产品。
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联川生物协助用户发表的单细胞和空间组学文章已有百余篇，联川将一如既往以专业的素养和真诚的服务继续助力用户的科研成果转化。此外，联川在服务进程中，构建了宝贵的空间多组学知识体系，由联川多部门多人员参与撰写的《走进单细胞研究新篇章--空间组学时代》已经上线，期望通过此书帮助更多科研学者充分理解空间多组学的技术内涵和应用场景，让更多的研究人员应用空间多组学技术解决科研问题。新书通过五大章节全面解析空间多组学研究，除此之外还增加了“单细胞特别篇”，聚焦2023年单细胞新技术和新应用。这本书无论对于初学者还是老司机来说，都是一本非常实用的学习资料，其中多数内容具备很好的参考和借鉴价值。
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