常规高通量测序文章，特别是高分测序文章，测序数据展示的内容在文章中仅仅占非常小的比重，更多的是后续的功能验证。一般包括体外细胞实验（in vitro）和体内动物实验（in vivo），这已经成为常规测序研究文章的基本框架。
但是对于单细胞测序而言，由于其技术和研究角度的特殊性，文章结构和常规测序类文章相比还是有比较大的差别。整理归纳单细胞文章的思路，可以明显发现单细胞文章分为三种主要思路：1）图谱类文章；2）图谱分析基础上选定特定细胞类型，增加功能验证；3) 分选特定细胞进行功能研究。单细胞文章中，图谱类文章较多，原因之一是单细胞技术应用方向多，数据挖掘角度也多，纯做生信分析就能解释很多生物学问题和医学问题；原因之二是验证困难，图谱分析发现了目标细胞群体，但是由于目标细胞的marker 基因编码的可能不是表面蛋白，无法分选细胞做功能分析；原因之三是目标细胞一般都属于罕见细胞，即使可以做细胞分选，但是由于细胞数量太少而得不到足够的细胞（有时细胞量少可以选择做 SMART-seq 或者 Fluidigm C1 平台低通量单细胞测序，分析特定细胞基因表达模式和功能聚类）。
图谱类文章主要的文章结构为：单细胞测序构建特定组织、器官、疾病类型（肿瘤、肥胖等）细胞图谱或特定组织不同发育阶段的细胞图谱，在细胞聚类的基础上，对所有或者特定几个细胞Cluster 做细节描述，包括细胞类型、细胞比例、marker 基因、参与的通路等，主要是以测序结果描述为主，比较依赖于数据分析。此类文章对于功能试验依赖很小，基本不会涉及功能验证，主要的验证手段是共聚焦免疫荧光、smFISH、IHC，通过这些操作证明数据分析得到的细胞类型是真实存在的，样本间细胞构成比例变化也是真实的。
图谱基础上选定特定细胞类型，增加功能验证，此类文章一般又会分为两大类：体外细 胞功能验证（可能涉及体内表型分析）和基因突变模式动物的构建，其中前者占比更高。此类文章首先也要做FISH、smFISH、IHC、共聚焦免疫荧光，然后继续做细胞体外功能验证。体外细胞功能验证一般包括分选阳性细胞和阴性细胞的bulk 测序（细胞量少时选择做SMART-seq或者Fluidigm C1平台低通量单细胞测序）、细胞表型分析（原代细胞，主要做细胞共培养、细胞分化分析）以及特定细胞体内注射，分析体内表型变化。
单细胞测序后构建基因突变模式动物做体内功能验证，此类文章的技术难度和工作量比较大，周期比较长，但一般文章档次比较高。选择做这类验证工作，也有另外一个情况，那就是同方向单细胞研究文章比较多，只能选择在功能验证上做突破。
分选特定细胞进行单细胞测序是目前单细胞研究越来越关注的一个方向。随着单细胞测序转拓展到各个研究领域，科研竞争越来越大，特别是在最基础的单细胞图谱研究方向，极易出现idea“撞车”的情况，因此纯图谱研究出现细胞总数、样本类型增多（全图谱）的趋势，相较于这种大成本的投入，科研工作者更加倾向于只针对某类细胞做单细胞研究，分析讨论深度相比“大图谱”有明显提升，也会涉及到后续特定细胞功能的验证。图谱研究开始从“大图谱”向特定细胞的精细化“小图谱”转变。
一种情况是通过流式细胞仪将特定的细胞分选处理，随后利用bulk RNA-seq、RT-qPCR或者western blot检测目标基因的表达。此外，流式细胞仪也可以用来检测免疫细胞浸润情况、验证细胞亚群是否存在以及细胞亚群比例等。
另一种情况分别分选多类细胞，通过SMART-seq得到多类细胞的表达谱，然后与单细胞数据中的细胞亚群进行相关性分析。通过相关性分析，一方面可以辅助于细胞鉴定，另一方也可以进一步确定单细胞测序结果的准确性。
FISH（fluorescence in situ hybridization），是利用核酸分子的碱基互补配对原则，将人工设计的外源核酸片段（即探针）与细胞中的待测RNA 互补配对，经变性-退火-复性，即可形成靶核酸与核酸探针的杂交体，在荧光检测体系下对RNA进行定位，定性或半定量分析。FISH是单细胞文章中最常见的验证实验，验证成功率非常高，是首要推荐的基础验证实验。Fish实验不仅可以验证单细胞数据中的marker基因的相对定量结果，同时可以观察到marker基因在组织中对应的细胞群中的空间定位。
以23年发表在Ecotoxicol Environ Saf.上的一篇文章“Effect of high alkalinity on shrimp gills: Histopathological alternations and cell specific response[1]”为例，作者通过FISH染色在实验组肾细胞中检测到了正常肾细胞中几乎不表达的柱状细胞标记基因CAC的信号从而进一步验证了单细胞拟时序轨迹分析的结果。
免疫荧光实验是根据抗原-抗体反应的原理，将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体或抗原作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原或抗体。利用荧光显微镜观察标本，荧光素受到激光的激发照射而发出明亮的荧光（红色或绿色），就可以看荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原就抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。此验证手段针对的是蛋白水平验证，同RNA FISH一样，免疫荧光不仅能验证单细胞测序中不同细胞的marker基因定量结果，也可以观察到不同marker基因在组织中的空间定位。
以24年6月发表的文章“Single-cell and bulk RNA-seq unveils the immune infiltration landscape associated with cuproptosis in cerebral cavernous malformations[2]”为例，作者通过免疫荧光实验来验证某些关键基因在脑海绵状血管畸形（CCMs）中的表达，在HS队列中，通过免疫荧光共定位和评估CCMs样本中的蛋白表达水平，进一步证实了这些中心基因的实际表达。观察到BTBD10、CEMIP和PFDN4与VE-cadherin（ECs的特征标记）在CCMs组织中的共定位。此外，结果显示CCMs组中BTBD10、CEMIP和PFDN4的水平显著高于对照组，这表明这些中心基因在CCMs组织中的功能表达。
免疫组化（IHC），是应用抗原与抗体特异性结合的原理，通过酶标抗体与底物反应显色，从而对组织细胞内抗原进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术。免疫组化（IHC）具有特异性强、敏感度高、定位准确的优点。
以22年发表在Oncogene上的一篇文章“Single-cell RNA-seq recognized the initiator of epithelial ovarian cancer recurrence[3]”为例，在研究中，特别提到了CYR61基因，它在原发性肿瘤中的“应激”亚群中表达，并被认为是复发的启动因子。IHC分析显示，与原发肿瘤相比，复发肿瘤中CYR61+肿瘤细胞的百分比显著升高，且与scRNA-seq结果是一致的，这表明CYR61+肿瘤细胞可能是复发肿瘤的起源。
根据单细胞数据挖掘基础上，对特定细胞/特定基因的功能进行下游验证，对于特定细胞功能验证主要涉及到细胞增殖活力检测（如MTT法，CCK-8法等），克隆形成率检测，细胞迁移侵袭检测（如划痕实验，Transwell 实验等），流式检测细胞周期凋亡，细胞周期检测，细胞凋亡检测等方法；细胞体内/体外共培养，通过单细胞分析技术识别出在细胞间存在相互作用的特定细胞类型，进行体外共培养验证其相互作用关系，并结合q-PCR等验证功能相关基因的表达变化；对于特定基因的功能验证主要涉及到基因的敲除/过表达实验。
以23年发表在Genome Biology上的一篇文章“Single-cell resolution analysis reveals the preparation for reprogramming the fate of stem cell niche in cotton lateral meristem[4]”为例，研究研究结果表明，初生维管细胞是响应外部刺激并经历细胞命运转变的主要细胞类型。通过进一步的发育轨迹和基因调控网络分析，研究者们鉴定了41个与激素响应相关的基因，包括LAX2、LAX1和LOX3，这些基因在Jin668和TM-1的初生木质部和形成层区域表现出不同的表达模式。此外，研究还发现了一些新基因，如CSEF、PIS1、AFB2、ATHB2、PLC2和PLT3，它们参与了再生过程。为了验证这些基因的功能，作者采用了CRISPR/Cas9基因编辑技术和过表达实验。他们特别研究了LAX2、LAX1和LOX3基因在愈伤组织增殖和植物再生中的作用。通过这些实验，再次证明了这些基因在棉花的再生过程中发挥了重要作用。例如，LAX2基因的过表达能够促进初生维管组织细胞的增殖和胚性愈伤组织的形成，而LAX1和LOX3基因的敲除则会影响愈伤组织的增殖率。
细胞谱系示踪 (cell lineage tracing) 是指利用各种方式标记细胞，并对包括其后代所有细胞的增殖、分化以及迁移等活动进行追踪观察。谱系示踪技术为研究器官发育、组织损伤修复以及单细胞的分化命运提供了重要的手段。近些年，随着基因工程技术的飞速发展，细胞谱系示踪技术也有所突破，体内的细胞追踪技术主要基于Cre-loxP同源重组系统。当含有Cre的转基因小鼠与含有loxP位点的报告基因小鼠交配后，Cre通过识别loxP位点，将两个loxP位点之间的终止序列切除，从而使含有Cre的细胞类群表达出报告基因。由于这种切除是位于基因上的，从而是永久性的和不可逆的，因此所有表达Cre的细胞类群及其后代（无论是否表达Cre）都将永久的被报告基因蛋白标记上。利用该细胞追踪技术可以解析特定细胞的起源和命运，可以有效应用于单细胞测序在发育、分化领域的后续验证工作。
以22年发表在Cell上的一篇文章“Lineage tracing reveals the phylodynamics, plasticity, and paths of tumor evolution[5]”为例，作者使用了一种基于CRISPR的谱系示踪系统，该系统能够在小鼠模型中高分辨率地追踪肿瘤的进化。这个系统被称为KP-Tracer小鼠模型，它允许研究者从单细胞水平上监测肿瘤的起始和发展，一直到形成侵袭性肿瘤的全过程。
[1] Ge Q, et al. Effect of high alkalinity on shrimp gills: Histopathological alternations and cell specific response. 2023 May:256:114902.
[2] Chen C, et al. Single-cell and bulk RNA-seq unveils the immune infiltration landscape associated with cuproptosis in cerebral cavernous malformations. 2024 Jun 5;12(1):57.
[3] Kan T, et al. Single-cell RNA-seq recognized the initiator of epithelial ovarian cancer recurrence. 2022 Feb;41(6):895-906.
[4] Zhu X, et al. Single-cell resolution analysis reveals the preparation for reprogramming the fate of stem cell niche in cotton lateral meristem. 2023 Aug 25;24(1):194.
[5] Yang D, et al. Lineage tracing reveals the phylodynamics, plasticity, and paths of tumor evolution. 2022 May 26;185(11):1905-1923.e25.
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