备战国自然2025之肿瘤微生物组:
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在之前的肿瘤微生物组检测中提到，为了顺利地开展瘤内微生物检测，需要小心外源菌对检测结果的干扰，因为在空气中、实验器械上、试剂耗材里都携带着或多或少的微生物，而这些微生物的存在会干扰我们判定哪些菌是瘤内真实检出的。如何降低乃至杜绝这些污染菌对检测结果的影响，在实验设计中应该具体怎么做呢。
RIDE checklist提供给研究者一个可参照的开展低微生物量样本的微生物组研究的最低标准检查表，于2018年首次在Trends in Microbiology上提出。这个检查表包括四部分内容：
(Report) 报告用于减少污染并评估污染影响的实验设计和方法；
(Include) 包括评估污染DNA的控制措施。每批取样、核酸提取以及扩增必须包括一种类型的阴性对照(取样空白对照、DNA提取空白对照和无模板扩增对照)；
(Determine) 通过将生物样本与对照进行比较来确定污染程度；
(Explore) 探索每项研究中的污染菌群，并报告它们对生物样本解释的影响。
建议不同的样本组或处理应随机进行，而不是单独操作。研究人员应戴一次性实验手套，戴口罩，避免皮肤裸露，以减少污染DNA进入样本。应将尽可能多的流程(例如，样本转移、DNA提取、文库制备以及测序)放在清洁、独立的工作环境中进行，而使用到的设备和耗材都应经过必要的去污染处理（图1）。
图1 降低低微生物量样本中污染物DNA影响的建议方案
在对低微生物量样本进行菌群16S测序时，应在多个实验环节上设置对照，包括用于监测污染DNA背景水平的阴性对照：采样空白对照、DNA提取空白对照，和无模板扩增对照。此外，如需确定检测极限，并确认交叉污染不会影响研究结果，则可以设置两种类型的阳性对照：DNA提取阳性对照和阳性扩增对照。尽管阴性对照样本通常会产生数量和质量较低的文库，但仍然应该对它们进行测序和下游的数据分析，以便与实验样本进行比较，去除污染菌。
(i)采样空白对照
这可以检测采样过程中引入的污染物DNA，包括用于采集样本的物品，如棉签、纱布等，用于储存或运输样本的任何试剂或防腐剂(如培养基、酒精或RNA稳定剂)。在取样空白中检测的材料应与生物样本同时在同一房间内采集，并应与生物样本从采集到测序进行相同的实验处理。虽然采样对照将包含提取过程中的DNA，但它将使研究人员能够辨别哪些污染物是特定于采样地点和设备的，而不是实验室。
(ii)DNA提取空白对照
这会在DNA提取过程中监测提取试剂盒、分子试剂和实验室环境中的污染物DNA含量，如上所述，应与生物样本一起从提取到测序进行相同的处理。
(iii)无模板扩增对照
这会在文库制备和测序过程中监测试剂和实验室环境中存在的污染物DNA。所有阴性对照提供了背景污染物的半定量估算，并允许研究人员识别可用于下游扣除分析的污染物。
目前有三种不同的策略来评估微生物组数据中污染的影响：(i)将对照与生物样本进行比较，(ii)从生物样本中扣除污染物，以及(iii)使用预测模型来识别假定的污染物。每种方法的严格程度和适用范围各不相同。
(i)生物样本与对照的比较可用来评估污染程度和污染物类别。必须测定每批样本的污染水平(即污染DNA的本底水平)，因为污染DNA的水平会因不同的方法学和时间而变化。在阴性对照中检测到的菌群必须报告。这对于确保样本类型或处理之间的菌群丰度或组成的显著差异不是由污染的菌群驱动的尤其重要。
(ii)在阴性对照中检测到的污染物菌群可以在分析过程中从生物样本中扣除(过滤)。一种方法是从生物样本中去除在阴性对照中发现的所有菌群。这是一种极其保守的方法，可能会导致生物样本中的DNA交叉污染到阴性对照中而导致生物信号的丢失。此外，与常见污染物菌群密切相关的菌群可能真的存在于生物标本中(例如假单胞菌)，但会被这种方法去除。在交叉污染严重或者猜测生物样本中存在与常见DNA污染物密切相关的菌群时，建议使用更细致的过滤方法，可以更好地识别要扣除的污染物。最后，如果污染物菌群在过滤后仍驱动生物信号，则应使用不同的方法进行验证，例如FISH。
(iii)生物信息学模型可用来评估生物样本中污染菌群的来源和比例。例如，SourceTracker分析使用贝叶斯建模来估计来自数据集的潜在污染物菌群的比例。为此，空白对照可以作为污染物的“源”，生物样本可以作为“汇”来估计生物样本中污染物菌群的来源和丰度。随后，样本中污染物DNA的相对贡献可以考虑到下游分析和数据解释中。
下表给出的细菌菌属已在多项研究中报道可从阴性对照样本中检出，因此如果在你的瘤内微生物实验中发现这些菌，需要小心辨别是否真实存在于你的样本中。使用表1时，你也应该注意：
1. 表1给出的是属水平的细菌，而实际的污染菌可能只是属分类下某个或某几个种水平的细菌；
2. 不要直接否定这些菌在肿瘤组织中的存在，但应保持警惕和怀疑的态度；
3. 如果这个（些）菌在你的结果里是核心菌，你需要用其他证据（比如IHC、FISH、培养组学等）来证明这些菌不是来自污染。
表1 阴性对照中鉴定出的细菌菌属
*文献序号出自参考文献
Eisenhofer R, Minich JJ, Marotz C, et al. Contamination in Low Microbial Biomass Microbiome Studies: Issues and Recommendations. Trends Microbiol. 2019 Feb;27(2):105-117.
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