项目经验分享|关于流式细胞阴选，你还需要知道哪些信息？

随着单细胞和流式技术的不断发展，目前单细胞的研究方向从原先的大图谱逐渐过渡到了小图谱，也就是从想要拿到样本中“尽可能全的细胞类型”过渡到了针对“某一关键的细胞群进行更精细化”的研究，那这个时候就需要借助流式这一平台来进行样本前处理操作。

通过流式细胞仪将所关注的目标细胞分选出来之后再进行单细胞测序，更聚焦的同时也能拿到更多关于所关注目标细胞的核心信息。但是是不是所有关注的目标细胞都建议进行流式分选？流式阳选or阴选的区别是什么？当目标细胞占比极低的时候是否还能进行流式分选？等诸如此类的问题我们又有哪些建议，本文一并汇总解决，协助有相关研究需求的客户从样本端解决后续一系列可能存在的潜在问题，无后顾之忧，实现高精准的单细胞数据挖掘。

流式细胞阴选分选是通过使用荧光标记的阴性标志物来识别和排除不需要的细胞，从而获得目标细胞的过程。

流式细胞阳选分选是通过使用荧光标记的阳性标志物来识别和选择目标细胞，从而获得目标细胞的过程。

纯度方面，阳选在理想情况下可以获得较高纯度的目标细胞。如果抗体特异性高，且仪器设置合理，能够准确地分选出发荧光信号的目标细胞。但是，在实际操作中，可能会由于抗体的非特异性结合等因素导致一些非目标细胞也被分选进来。得率方面，取决于目标细胞在原始细胞群体中的比例。如果目标细胞比例较低，即使纯度较高，实际获得的细胞数量可能也有限。例如，在分选一种只占细胞群体 1% 的罕见细胞时，即使纯度可以达到 90%，实际得到的细胞绝对数量可能也不多。

纯度上，阴选可以有效地排除非目标细胞，但可能会受到死细胞和细胞碎片的影响。因为死细胞和细胞碎片通常不会结合抗体，可能会被误分到目标细胞群体中，从而影响纯度。得率方面，同样受原始细胞群体中目标细胞比例的影响。而且，由于阴选是排除非目标细胞，在一些情况下，如果非目标细胞数量庞大，可能会导致在排除过程中损失部分目标细胞，从而影响得率。

可以进行流式阳选操作，但是低含量细胞的分选会导致低纯度及低回收率。因此，我们建议使用者事先富集你感兴趣的细胞。

细胞富集的方式可以是正选：如用磁珠法富集你感兴趣的细胞，比如如果您的目标细胞是NKT细胞，本身占比极低，是否可以先用CD45磁珠分选出CD45+的细胞之后，再流式分选NKT细胞；

当然也可以采用阴选，如或磁珠法去除不要的细胞之后，再对自己感兴趣的细胞进行流式分选，例如本身是高富含免疫细胞的组织，但是实际关注的细胞类型为CD45-细胞，那实际操作过程中可以先用磁珠去除掉大部分的CD45+细胞之后再用流式进行更精准的分选。

以上这些操作可以节省流式分选时间保证最初分选下来的细胞状态的同时也能更好地维持流式阳选/阴选分选暂占比极低的细胞的纯度。

目前针对于目标细胞占比极低的样本，我们不建议做流式阴选，主要原因如下：

当目标细胞占比极少（1% 以下）时，非目标细胞数量庞大。在流式细胞术阴性选择过程中，需要使用抗体标记非目标细胞来进行去除。但大量的非目标细胞可能会产生复杂的背景信号，这些背景信号主要来源于非目标细胞自身的自发荧光、非特异性抗体结合等情况。例如，在一些组织样本中，存在多种不同类型的非目标细胞，它们的自发荧光特性各不相同，这会干扰对标记抗体荧光信号的准确识别，使得准确区分和去除非目标细胞变得困难。

流式细胞仪的分选准确性是有限的。在目标细胞占比极低的情况下，仪器在区分目标细胞和非目标细胞时更容易出现误差。由于细胞样本中大部分是非目标细胞，在分选过程中，少量的目标细胞可能会被误判为非目标细胞而被去除，或者非目标细胞被错误地保留下来。例如，在高速分选过程中，细胞通过检测区域的时间非常短暂，当目标细胞和非目标细胞的荧光信号差异较小时（这种情况在目标细胞占比低、背景信号复杂时更容易出现），仪器可能无法准确地进行判断。

要有效地富集目标细胞，需要尽可能完全地去除非目标细胞。然而，当目标细胞占比过低时，即使能够去除大部分非目标细胞，剩余的非目标细胞相对目标细胞而言仍然可能是一个较大的数量。例如，假设最初样本中有 100 万个细胞，目标细胞占 0.5%（即 5000 个），即使去除了 99% 的非目标细胞，剩下的非目标细胞数量可能仍然会高于目标细胞数量，从而难以达到理想的富集效果。

流式细胞术阴性选择（流式阴选）得率低可能是由以下多种原因导致的：

1. 样本质量差

   细胞活性低：如果样本中的细胞在采集或处理过程中受到损伤，如温度不适、长时间放置、机械损伤等，导致细胞活性下降。例如，在血液样本采集后，如果没有及时处理，血细胞可能会因为缺氧等因素而死亡。死亡细胞可能会在流式分选过程中被误判或丢失，从而降低得率。

   细胞浓度不合适：样本细胞浓度过高或过低都会影响分选效果。浓度过高时，细胞容易聚集，导致流式细胞仪在识别和分选细胞时出现错误，部分目标细胞可能无法被正确分选。浓度过低则会导致在分选过程中能够收集到的目标细胞数量有限，降低得率。例如，在进行淋巴细胞阴选时，如果淋巴细胞浓度过低，经过分选后获得的目标淋巴细胞数量就会很少。

2. 样本类型复杂

 细胞种类繁多：当样本中存在多种细胞类型，且这些细胞在大小、形状、表面标志物等方面有相似之处时，阴性选择的难度会增加。例如，在肿瘤组织样本中，除了肿瘤细胞外，还有大量的正常细胞，如成纤维细胞、免疫细胞等。如果想要通过阴性选择去除非肿瘤细胞来富集肿瘤细胞，由于细胞种类复杂，很容易导致目标肿瘤细胞的丢失，使得到率降低。

 存在干扰物质：样本中可能含有杂质、细胞碎片、自身抗体等干扰物质。细胞碎片可能会堵塞流式细胞仪的管道，影响分选的流畅性，并且可能会被错误地识别为细胞，干扰目标细胞的分选。自身抗体可能会与细胞表面标志物结合，改变其正常的抗原表位，从而影响流式细胞仪对目标细胞的识别，降低分选的准确性和得率。

1. 抗体特异性差

   所使用的用于阴性选择的抗体可能会与非目标细胞表面的抗原发生交叉反应。例如，在通过流式阴选去除T细胞来富集B细胞时，如果抗T细胞抗体与某些B细胞亚群表面的抗原也有结合反应，就会导致部分B细胞被错误地去除，从而降低B细胞的得率。

2. 抗体标记效率低

   抗体与荧光染料等标记物的结合效率不高。如果抗体标记不充分，在流式细胞仪检测过程中，目标细胞可能无法被有效地识别和分选。例如，用于标记非目标细胞的荧光抗体没有足够的荧光强度，流式细胞仪的激光激发后产生的荧光信号很弱，使得部分应该被识别为非目标细胞的细胞没有被正确识别，最终混入目标细胞群中，导致真正的目标细胞得率下降。

3. 抗体用量不当

   抗体用量不足时，不能充分结合非目标细胞，会导致部分非目标细胞无法被标记，从而混入目标细胞群，降低得率。相反，抗体用量过多可能会导致非特异性结合增加，使更多的细胞被错误地标记为非目标细胞而被去除，也会降低目标细胞的得率。

1. 仪器参数设置不合理

   分选阈值设置错误：如果分选阈值设置得过于严格，可能会将一些本应被收集的目标细胞排除在外。例如，在设置荧光强度阈值时，如果阈值过高，部分荧光强度稍低的目标细胞（虽然这些细胞也是目标细胞，但荧光信号稍弱可能是由于细胞个体差异等原因导致的）就会被判定为非目标细胞而被舍弃，从而降低得率。

  流速设置不当：流速过快会导致细胞在流式细胞仪中的停留时间过短，激光激发和检测细胞的时间不足，可能会使部分目标细胞无法被准确识别和分选。流速过慢则会降低分选效率，在长时间的分选过程中，细胞的状态可能会发生变化，也会影响得率。

2. 仪器性能问题

   流式细胞仪的激光光源强度不稳定、光学系统的校准不准确、探测器的灵敏度下降等都会影响细胞的检测和分选。例如，激光光源强度下降，会导致荧光激发效率降低，细胞产生的荧光信号变弱，使得目标细胞的识别和分选受到影响，得率降低。探测器灵敏度降低会导致无法准确检测到细胞发出的微弱荧光信号，从而丢失部分目标细胞。

高钙化的组织，结缔组织等本身解离过程中会产生很多碎片的组织类型，不建议进行流式阴选，因为细胞碎片大部分不会被抗体标记进而导致流式阴选得率较低。

目前常见的流式分选仪可以从一个样品中最多同时分选出2种、4种或6种不同的细胞，但是我们建议最多同时分选两种细胞，因为单细胞测序要求细胞具有较高的活性。在分选过程中，多种细胞同时分选可能会延长分选时间，增加细胞在体外环境中的暴露时间，从而导致细胞活性降低。且在分选开展之前需要提前评估目标细胞的占比以及对应的抗体所需要的荧光通道。

Tips：目前针对流式和磁珠我们均可以开展细胞分选实验，目前搭配的是美天旎的磁力架和3台BD的流式细胞仪，全面供应单细胞测序的细胞分选实验。

当所分选的细胞占比极低的情况下，可以采用磁珠分选掉大部分的非目标细胞之后再采用流式做更精准的分选目标细胞，但是同样也会存在分选之后细胞纯度不佳的问题。

假设所关注的目标细胞占总数的5%，那需要准备的初始细胞数的换算公式如下：50000=5% x 50%回收率 x 初始细胞数。高速分选、纯度模式(yield（富集）,purity,4-way purity,single cell)、部分细胞黏附于上样管壁、部分细胞用于样本分析、长时间分选过程中细胞的死亡等等，对会降低回收率。50%回收率是一个一般的参考值。

理论上，空气激发的流式纯度为99%，石英杯激发的为98%。具体与起始细胞浓度、目标细胞的占比、分选速度、分选模式相关，通常单次分选都可达到90%以上。

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