NC：GWAS+meQTL/孟德尔随机化揭示DNA甲基化影响儿童身高

本研究涵盖来自印度、冈比亚和英国的五个队列儿童数据。印度的MMNP和MPC、冈比亚的PMMST和ENID为中低收入国家队列，英国的ALSPAC是高收入国家队列。

MMNP是关于母亲饮食质量对后代出生结局影响的随机对照试验；MPC旨在评估母亲孕期营养状况对孩子心血管和认知结局的长期影响；PMMST研究孕前微量营养素补充对胎盘功能的作用；ENID探究产前和婴儿营养补充对婴儿免疫发育的影响；ALSPAC是对父母和儿童的纵向研究。

各队列均获得儿童父母知情同意，其详细信息总结于上图的表格中。

在MMNP队列作为发现队列开展EWAS研究，使用的是illumina的850k DNA甲基化芯片中的β值进行分析。

通过广义线性回归模型，调整儿童年龄、性别和甲基化衍生的替代变量（SVs）后，在Chr17染色体上发现三个CpG（cg11047325、cg13343932、cg18181703）与身高显著相关（FDR<0.05），几乎都在SOCS3基因的exon2附近。

这三个CpG的甲基化水平强相关（Pearson's r≥0.75），效应大小相似，1%的甲基化增加与平均0.25厘米的身高增加相关。同时，计算的基因组膨胀因子λ=0.98（Fig.2b），表明不存在基因组膨胀现象，且调整估计血细胞计数或母亲补充剂后，关联无显著变化。

另外，对该区域进行差异甲基化区域（DMR）分析，也发现相同的441bp区域与身高相关（调整P值(Stouffer)=2.1×10⁻¹¹）。

在三个中低收入国家的儿童中期横断面分析队列（MPC、PMMST、ENID）中对发现阶段的SOCS3的甲基化-身高关联进行重复验证。

在这些队列中，均观察到一致的效应方向，P值范围从0.047到3×10⁻¹⁴，且甲基化水平在各重复队列中同样呈现相关性。

在冈比亚的ENID队列中，还针对2岁儿童进行了早期儿童效应的关联分析，发现cg18181703的甲基化与身高显著相关（P=1×10⁻³）。敏感性分析表明，细胞计数变化对任何重复队列中的SOCS3甲基化-身高关联均无影响。

此外，在高收入国家的ALSPAC队列中，也成功重复并验证了这一关联结果（P=2.2×10⁻³），且细胞组成变化对该关联无影响。

发育迟缓定义为身高低于WHO年龄身高参考均值2个标准差，在中低收入国家儿童中较为常见。

印度队列中发育迟缓儿童占比10-15%，冈比亚队列中2岁时发育迟缓患病率较高，达24%，但5-7岁时降至5-8%。

在所有中低收入国家队列中，通过构建逻辑回归模型，将发育迟缓作为二元结果变量，SOCS3甲基化作为暴露因素，调整儿童年龄、性别、甲基化芯片批次效应等因素后进行分析。

结果发现，在发现队列（MMNP）中，SOCS3甲基化与发育迟缓呈负相关，1%的甲基化水平增加与发育迟缓相对风险平均降低9.0%相关（最大P=1.4×10⁻⁴）。

该关联在MPC和ENID2岁队列中得到重复验证，但在其他冈比亚队列（PMMST和ENID6岁）中未被重复出来，可能与这些队列中发育迟缓率较低和样本量较小有关。

在中低收入国家队列中，针对三个SOCS3 CpG位点进行cis-mQTL分析及Meta分析，未发现显著cis-mQTLs，表明SOCS3甲基化不受cis-遗传变异影响。检测cg18181703的trans-mQTL（rs4383852），仅在PMMST队列中有名义关联且不混淆主效应。

通过身高PRS进行敏感性分析，发现SOCS3 CpG位点效应大小在调整PRS后无变化，说明SOCS3甲基化可独立预测儿童身高。

由于高收入国家队列ALSPAC主要为欧洲人群的遗传背景，因此研究了遗传变异对SOCS3甲基化-身高关联的影响。首先对已知的cg18181703 trans-mQTL（rs4383852）进行敏感性分析，调整rs4383852基因型本身不改变效应估计值。

然而，当进一步调整PRS后，cg18181703与身高的关联减弱，这表明在高收入国家队列中，遗传因素对身高的影响可能更为复杂，且与SOCS3甲基化存在一定的相互作用。

通过单因素方差分析（ANOVA）模型评估各队列中平均后的SOCS3甲基化水平（三个CpG均值后的值）和身高PRS解释的身高方差比例，发现中低收入国家队列中二者解释量相似，高收入国家ALSPAC队列中SOCS3甲基化解释方差远低于身高PRS。

在MPC队列中进行纵向分析，该队列拥有从出生到21岁不同时间点的身高测量数据。通过构建联合ANOVA模型，研究从出生到成年期间，5岁期间测量的SOCS3甲基化水平和成人身高PRS对身高方差的分配情况。

结果发现，SOCS3甲基化和身高PRS在整个童年和青春期解释的身高方差相似，但在21岁时，身高PRS解释的身高方差显著多于SOCS3甲基化水平（分别为18% vs 1%，95%置信区间）。

此外，分析SOCS3甲基化在5岁时与5至21岁各个时间点的身高关联，发现虽在所有时间点均存在关联，但效应强度随年龄下降。

进一步通过构建条件身高变量，分析身高增益情况，发现SOCS3甲基化仅在出生至5岁期间与身高增益强烈相关，且在13.5至21岁时，5岁时较高的SOCS3甲基化与身高增加减少相关。

为评估SOCS3甲基化的稳定性，在MPC队列中选取352名参与者，对其5岁（使用850k甲基化芯片）和21岁（焦磷酸测序验证）时DNA甲基化水平进行相关性分析。

结果显示，SOCS3甲基化在三个CpG位点在这两个时间点均呈现强相关性，表明SOCS3甲基化随年龄具有较高的稳定性，其甲基化状态在儿童期到成年期相对稳定，可能在长期的生长发育过程中持续发挥作用。

为探究SOCS3甲基化与身高之间的潜在因果关系，进行了孟德尔随机化（MR）分析。

使用先前在欧洲人群中确定的cg18181703的trans-mQTL rs4383852作为工具变量，结合公开可用的大型欧洲身高GWAS（n=253,288）的汇总统计数据，以身高为结局，甲基化为暴露进行分析。

通过“TwoSampleMR”R包计算，使用Wald比估计器量化因果效应，结果发现cg18181703的DNA甲基化水平对身高存在因果效应，1%的甲基化水平增加与0.07SD的身高变化相关（95%置信区间：0.03-0.11；P=1.7×10⁻³），为SOCS3甲基化影响身高提供了因果证据支持。

在三个中低收入国家队列（MMNP、MPC、ENID）中，研究母亲孕期多种暴露因素对SOCS3甲基化的影响，包括母亲体重指数（BMI）、社会经济地位（SES）、妊娠同型半胱氨酸、血浆/红细胞叶酸和维生素B12浓度等。

通过线性回归模型，以甲基化残差为因变量，母亲暴露因素为自变量，调整儿童年龄、性别和批次效应后进行分析。

结果发现，除母亲叶酸和SES外，大多数暴露因素与SOCS3甲基化无关联，且在印度队列中，母亲叶酸和SES与SOCS3甲基化强相关（MMNP中Pearson's r=0.16，P=8.9×10⁻⁴；MPC中r=0.23，P=2.2×10⁻⁸）。

由于二者可能存在混淆，进一步通过多元回归模型分析，发现叶酸和SES各自分别独立与SOCS3甲基化相关。

随后，通过MR分析探究母亲孕期叶酸水平与5岁儿童SOCS3甲基化之间的因果关系，首先在GWAS数据中搜索MTHFR基因1Mb范围内与叶酸水平相关的遗传变异，在印度队列中进行关联分析后确定两个编码基因的突变位点（rs1801133和rs2639453）作为叶酸暴露的遗传工具，MR分析未发现母亲叶酸暴露与5岁儿童SOCS3甲基化之间存在因果关系。

在MPC队列中，该队列同时具有儿童和成人的横断面数据，研究SOCS3甲基化与BMI之间的潜在联系。

通过线性回归模型，以调整性别和年龄后的BMI残差为因变量，SOCS3甲基化为自变量（多种技术检测平台等进行了批次矫正后）进行分析。

结果发现，SOCS3甲基化与21岁时的BMI呈负相关，这与先前研究结果一致，但在儿童期二者关系相反。

进一步进行敏感性分析，调整身高后，确认21岁时的关联仍然存在，但5岁时调整身高后无明显关联，表明SOCS3甲基化与成人BMI和身高可能通过不同的生物学途径产生关联。

对包含三个SOCS3CpG的441bp区域进行体外细胞机制验证，，发现SOCS3甲基化构建体有增强子活性。体外甲基化实验表明该区域甲基化会抑制增强子活性，进而抑制SOCS3表达，为SOCS3甲基化影响基因表达从分子生物学的机制层面提供了有利的证据。