Xenium技术是一种先进的空间原位分析技术，它通过使用特异性探针与原位的目标RNA分子进行杂交，然后利用循环荧光成像和图像识别技术来实现RNA的定量检测。因此Xenium技术的一个关键优势是其高分辨率，甚至能够实现亚细胞水平的空间分析。首先，Xenium的探针由两端基因特异性序列结构和中部荧光探针特异性杂交位点构成，当两端特异性序列精确匹配上目标RNA分析形成挂锁结构时，可以连接成环进行滚环扩增，形成带有高密度荧光探针特异性序列团，进而通过多轮荧光探针杂交成像，形成原位荧光信号序列。![]()
后续我们就可以根据json文件和原位荧光序列解码出原位的RNA信息。
为了确保基因检测的灵敏度，针对一个基因设计探针时，一般会设计多个探针集（probe set），即能够覆盖该基因所有的mRNA异构体的探针（probe）的集合，一个探针集可以含有一个甚至多个探针。如下图该基因设计有3个探针集，共有4个探针。最后，看看Xenium是如何通过循环荧光成像和图像识别技术来检出原位的RNA分子的。在每一轮的循环荧光成像中，通过一些图像处理（滚环扩增产物RCP的检测、过滤、光斑信号校正；各个视野FOV的对齐），再加上对每个循环每个通道的图像进行对齐等处理之后，针对同一个坐标位置（Xi，Yi，Zi）按照循环顺序，将其发光信号序序列（codeward）对照json文件解码之后就可以知道这个位置是什么基因。显然，如果两个相同的RNA分子相距太近，就会在后续数据处理（stitch）中被认为是一个RNA分子，这就是视觉拥挤（optical crowding）现象。视觉拥挤降低了大多数基因的检测灵敏度，并引入技术伪影（artifacts），影响数据质量。3.共表达且高表达的RNA被排在了同一个循环中发光。因此探针设计时，需要考虑尽可能纳入更少的高表达基因，并根据表达特征调整发光的循环和探针集数目。 Xenium In Situ适用于FFPE样本或OCT包埋样本。使用针对目标基因的探针panel来测量基因表达。目前已有的Pre-designed panel如上图，可以直接采用用于实验，当然也可以进行自定义基因探针的设计和定制。目前有以下类型的探针panel设计可供选择：（1）附加定制面板（Add-on custom panels）：基于Pre-designed panel（九大组织特异性panel list+两大泛组织panel list）为基础，还可以选择针对特定细胞亚群或在特定条件下表达的基因（例如疾病）设计探针，该部分的定制工作可在xenium-panel-designer上自行定制（网站链接：https://cloud.10xgenomics.com/xenium-panel-designer），目前可定制基因数为：（2）全定制面板（standalone custom panel）：面向人类和小鼠物种，当所要研究的组织和pre-designed panels覆盖的组织相比具有比较大的表达特征差异时，还可以进行全定制。该部分的定制工作可在xenium-panel-designer上自行定制（网站链接：https://cloud.10xgenomics.com/xenium-panel-designer）。定制基因数为： （3）物种全定制和高级定制（Species standalone and advanced custom ）：- 高级自定义的panel：SNVs, gene isoforms, gene fusions, viral sequences, bacterial sequences, fluorescent reporters, transgenes, CRISPR guides, CDR3 clonotypes, protein tags, barcodes (e.g. lineage tracing)等，
该部分的定制工作需要10x的应用生信团队介入进行定制。表：Xenium Panel Designer 工具可以进行探针设计的项目类型- Xenium通过显微镜成像结果中的亮点来区分不同的转录本，转录本表达量高会形成视觉拥挤，探测灵敏度下降，对其他转录本识别造成影响，影响数据质量；
- 一个特定区域内能识别出的亮点是有上限的，将高表达基因的亮的cycle尽量远离开来；
因此探针设计时，需要考虑尽可能纳入更少的高表达基因，并根据表达特征调整发光的循环和探针集数目。（1）A gene list：想要定制化的基因列表（Gene Name or Ensembl ID）（2）A pre-designed panel name：Pre-designed panel的基础上进行Add on（3）A single cell reference：最多五个单细胞参考数据集a. 非常建议：自行上传带注释的单细胞基因表达数据（所要做Xenium定制的样本的单细胞数据，数据格式HDF5、MEX或CLOUPE格式；Raw count matrix）；b. 从Xenium Panel Designer参考列表中选择相似组织类型和条件的公开参考数据；（4）Advanced custom need : 目标转录本的序列1.Xenium Panel Designer操作方法 1.1 进入Xenium Panel Designer网站，需要提前注册和登录。https://cloud.10xgenomics.com/xenium-panel-designer![]()
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1.2 网站首页介绍，点击【Start a New Panel】即可开展panel设计可以进入pre designed panel网页:https://www.10xgenomics.com/support/in-situ-gene-expression/documentation/steps/panel-design/pre-designed-xenium-gene-expression-panels查看详细的panel信息 ![]()
1.6 输入需要另外定制的基因（该步骤可后续重复进行）
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1.9 继续对panel进行优化（可选）：会重复步骤6-8首先是展示panel基础信息的Panel摘要部分： 最后是从各个维度展示panel设计时需要考虑的信息的panel设计细节部分：正如在Extended GBmap单细胞参考数据集中提示，肥大细胞可能有过高的panel利用率，根据该提示来推断您要实际使用的样本中是否存在该情况。 2.3 探针集摘要：查看优化前后每个基因的探针集数量变化 Xenium panel设计非常重要的一点是选择和所要研究的组织/疾病状态相似的单细胞转录组数据，因为这样才能根据panel设计摘要中的信息做出准确的判断和决定。panel设计时虽然我们只需要调整基因和探针集数目，但是当前设计时上传的单细胞数据也会被用于后续探针设计（安排基因在哪些循环亮起），因此单细胞转录组数据的吻合度非常重要。如果是泛癌或者不在pre-designed panel中的组织，选择一个最合适的pre-designed panel时还需要查看该pre-designed panel在哪些组织当中验证过。对应已验证的组织类型链接如下“https://www.10xgenomics.com/support/in-situ-gene-expression/documentation/steps/experimental-design-and-planning/xenium-in-situ-gene-expression-validated-tissue-list”
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