流式细胞术作为一种强大的细胞分析技术，在生命科学研究、临床诊断和免疫治疗等领域发挥着重要作用。其中，流式细胞阴选和阳选分选是流式细胞术的重要应用之一，但是流式分选过程中样本质量较差（细胞活率/目标细胞占比等）/抗体的选择/仪器的调试等均会影响分选的纯度及分选得率。本文将详细介绍流式阴选和阳选分选过程中的注意事项以及影响分选结果的因素，帮助读者更好地规避流式分选过程中所导致的问题。
一、流式基础介绍
流式细胞分选是一种从混合（异质性）细胞群体中分离出特定细胞亚群的的技术，是基于流式细胞检测技术上的实时分选。
二、流式细胞阴选和阳选分选差异
Ø 流式细胞阴选分选原理
流式细胞阴选分选是通过使用荧光标记的阴性标志物来识别和排除不需要的细胞，从而获得目标细胞的过程。
Ø 流式细胞阳选分选原理
流式细胞阳选分选是通过使用荧光标记的阳性标志物来识别和选择目标细胞，从而获得目标细胞的过程。
Ø 流式阳选的纯度和得率：
纯度方面，阳选在理想情况下可以获得较高纯度的目标细胞。如果抗体特异性高，且仪器设置合理，能够准确地分选出发荧光信号的目标细胞。但是，在实际操作中，可能会由于抗体的非特异性结合等因素导致一些非目标细胞也被分选进来。得率方面，取决于目标细胞在原始细胞群体中的比例。如果目标细胞比例较低，即使纯度较高，实际获得的细胞数量可能也有限。例如，在分选一种只占细胞群体 1% 的罕见细胞时，即使纯度可以达到 90%，实际得到的细胞绝对数量可能也不多。
Ø 流式阴选的纯度和得率：
纯度上，阴选可以有效地排除非目标细胞，但可能会受到死细胞和细胞碎片的影响。因为死细胞和细胞碎片通常不会结合抗体，可能会被误分到目标细胞群体中，从而影响纯度。得率方面，同样受原始细胞群体中目标细胞比例的影响。而且，由于阴选是排除非目标细胞，在一些情况下，如果非目标细胞数量庞大，可能会导致在排除过程中损失部分目标细胞，从而影响得率。
三、流式阴选和阳选分选过程的注意事项
1. 细胞活性：细胞活性是流式细胞术实验的关键因素之一，应尽量保证细胞的活性在 90%以上。
当细胞活率较低时，流式分选过程中假阴性结果增加，分选的准确性会下降，因为由于细胞状态较差，在通过分选装置时会出现误判/分选错误情况，从而降低了分选的准确性及纯度。
2. 细胞纯度：细胞纯度对流式细胞术实验结果的准确性和可靠性有重要影响，应尽量保证细胞样本的纯度。
当细胞纯度较差时，即使进行了流式阴选，仍可能有大量杂质细胞残留于分选后的样本中，导致目标细胞的纯度无法达到预期要求，进而导致再进行单细胞测序时，导致细胞亚群划分不准确，细胞异质性增加，结果的可靠性下降。同时也会导致分选速度降低。
3. 细胞密度：细胞密度应适中，不宜过高或过低。细胞密度过高会导致细胞之间的重叠和粘连，影响流式细胞仪的检测效果；细胞密度过低则会导致信号强度不足，影响数据分析结果的准确性。
1. 抗体和染料的特异性：建议应选择特异性强、亲和力高的抗体和染料，以避免非特异性染色和交叉反应。
如果抗体或染料的特异性不强，与非目标细胞表面的某些类似分子发生非特异性结合，那么这些非目标细胞就会被错误地标记为需要被阴选的细胞，从而导致假阳性结果进而降低了分选的准确性和纯度。
反之，若抗体或染料特异性过高，而目标细胞表面的相应标志物表达水平较低或处于某种特殊状态下未被有效标记，就可能导致目标细胞未被正确识别和分选，出现假阴性，影响了最终目标细胞的回收率和纯度。由于特异性不合适导致的假阳性和假阴性结果，会使得流式阴选过程变得混乱和不准确。
2. 抗体和染料的浓度：应根据实验需求和细胞类型，选择合适的抗体和染料浓度。
Ø 抗体和染料浓度过高会导致非特异性染色和细胞毒性增加；
Ø 抗体和染料浓度过低则会导致信号强度不足，影响数据分析结果的准确性。
3. 抗体和染料的保存条件：抗体和染料应保存在低温、避光、干燥的条件下，避免反复冻融和光照。过期的抗体和染料应及时更换。
1. 仪器校准：流式细胞仪应定期进行校准，以确保仪器的性能和检测结果的准确性。校准内容包括激光功率、荧光补偿、流速等。
2. 仪器维护：流式细胞仪应定期进行维护和保养，以延长仪器的使用寿命和保证仪器的性能。维护内容包括清洗管道、更换过滤器、校准光路等。
3. 实验操作规范：实验操作应严格按照操作规程进行，避免人为因素对实验结果的影响。如样本上样时应避免气泡的产生、细胞标记时应避免交叉污染等。
4. 样品回测：没有特殊情况（获得的细胞极少），分选得到的细胞最好都做一下回测以确定目标细胞群。
四、影响分选结果的因素
纯度：目标细胞占分选后细胞的比例，目前不建议流式阴选的项目中，目标细胞占比低于1%。
效率（efficiency）：分选的目标细胞占检测的目标细胞的比例
得率（recovery rate）：收集的目标细胞占检测的目标细胞的比例
细胞活率：分选的目标细胞中活下来的细胞比例
分选速度：
1) 分选纯度、效率和速度不可能同时达到最优，需要根据实验目的进行取舍。
2) 细胞活率主要由样本状态决定，喷嘴尺寸的选择也有很大影响。
3) 稳定的液流是一切分选的前提！
1. 分选纯度及其影响因素
Ø 稳定的液流和准确的drop delay值
Ø 纯度模式的选择：BD FACS Aria 中，纯度从低到高依次为 yield（富集），purity，4-way purity，single cell
1) 样本中细胞类型的多样性和异质性较高时，会增加阴选的难度，导致分选纯度降低。因为不同细胞表面标志物的表达情况不同，容易出现误选或漏选的情况
2) 细胞活性低会影响细胞表面标志物的表达和稳定性，进而影响阴选的效果。活性差的细胞可能会出现膜通透性改变、标志物脱落等情况，使得阴选过程中对目标细胞的识别不准确，从而降低分选纯度。
3) 抗体特异性不强是导致分选纯度降低的重要因素之一。如果抗体与非目标细胞表面的相似分子发生交叉反应，就会将非目标细胞误选为目标细胞进行分选，降低了分选的纯度。
总之，纯度要求越高，目标细胞被丢弃的比例越高。分选得率越低
2. 分选得率及其影响因素
Ø 稳定的液流和准确的drop delay值
Ø 得率一般与纯度无法同时达到最优，纯度提高，得率降低
Ø 减少冲突事件（conflict events），在一定范围内可以在不降低纯度的基础上提高得率
1) 较小的喷嘴形成较小的液滴，降低目标细胞和非目标细胞包裹在一个液滴内的可能性，从而提高得率。但小喷嘴会降低细胞活率
2) 较低的上样速度
3. 细胞活率及其影响因素
Ø 分选前细胞的状态（最重要的因素）：
1) 尽量温和的制备单细胞悬液
2) 使用死活染料在分选过程中去除死细胞：建议使用核酸染料，可以实时动态检测死细胞比例
Ø 分选中影响因素：
1) 喷嘴的选择：喷嘴越小，鞘液压力越大，细胞运动速度越快，活率越低
2) 合适的偏转电压，让液滴落在接收管液面上而非管壁上
3) 接收管包被：含有BSA或者FBS的buffer 4C过夜
4) 分选时间尽量短，保证合适的温度
流式细胞阴选和阳选分选是流式细胞术的重要应用之一，它们可以通过特定的荧光标记和细胞表面标志物的识别，将目标细胞从复杂的细胞群体中分离出来，为后续的研究和分析提供高纯度的细胞样本。本指南详细介绍了流式细胞阴选和阳选分选流式细胞术基础介绍、阴选和阳选分选的原理、实验流程、注意事项以及影响分选结果的因素，希望能够帮助读者更好地理解和应用这一技术。在实际应用中，读者应根据实验需求和细胞类型，选择合适的阴选或阳选分选方法，并严格按照操作规程进行实验，以获得准确可靠的实验结果。
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