肝脏是人体重要的代谢和内分泌器官，参与消化、糖脂代谢和免疫等多种生化过程。随着人类饮食结构和生活环境的改变，越来越多外源性物质如酒精、药物、化学制剂等更容易对肝脏造成损伤，进而导致肝脏纤维化、肝硬化甚至肝癌。肝脏疾病患者正在逐年升高，肝脏疾病已成为一个全球范围的健康问题。目前治疗肝损伤的药物如联苯双酯、水飞蓟宾、硫普罗宁、双环醇片等，长期服用会产生一定的毒副作用。近年来，各种天然植物及其提取物被用于各种疾病的治疗和预防，天然产物具有平稳，毒副作用小等优点，所以在天然植物中寻求一种更加安全有效的护肝药物或功能性食品变得尤为重要。
蘑菇作为药物和功能性食品应用已有数千年的历史，世界范围内大约有15000种蘑菇被发现，其中有650种被认定为药材，在中国有记载的食用菌已超过1000种。双孢菇又称白蘑菇、纽扣蘑菇、蘑菇科蘑菇属的大型真菌，在全球食品市场广受欢迎。有研究显示，双孢菇乙醇提取物具有较强的抗氧化活性，可显著提高肝脏、心脏和血清中的抗氧化酶的活性，同时双孢菇甲醇提取物对小鼠的肝癌具有一定的改善作用。探究双孢菇对肝脏的保护作用，对双孢菇产品的开发利用以及肝脏疾病的预防有着重要意义。
众所周知，四氯化碳 (CCL4) 是一种优良的有机溶剂，在工业生产中常被用作脱脂、提取溶剂，具有急性肝毒性，被广泛应用于肝损伤实验动物模型，其作用机制已被广泛报道。因此，本研究采用LC-MS/MS 技术对双孢菇乙醇提取物的化学成分进行鉴定，采用网络药理学方法，对相关化合物保肝活性的作用靶点及通路进行预测，同时使用四氯化碳致小鼠肝损伤动物模型对相关靶点进行验证，为双孢菇开发肝损伤保护功能食品提供理论依据。
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分析
双孢菇子实体80%乙醇提取物(ABEE)
NO.1
ABEE中有效成分鉴定结果
采用LC-MS/MS技术对双孢菇乙醇提取物的化学成分进行快速鉴定，将质谱数据与BGILibrary数据库进行匹配，根据各色谱峰的得分信息对所鉴定化合物进行初步筛选，并根据各成分的一级质谱信息和二级质谱信息进一步确定。由图1 可知，各色谱峰保留时间与响应强度重叠度较高，仪器数据采集稳定性高，数据可靠。
进一步以数据库分析鉴定的Level、Match值为筛选条件进行筛选，当Level 值大于 2及Match大于85时化合物可信度较高，给予保留， 31个化学成分在负离子模式下被鉴定(表2)， 44个化学成分在正离子模式下被鉴定得到(表3)，两种模式下重复的化合物均统计在正离子模式下，共得到75个化合物，脂肪酸、氨基酸和羧酸等类型化合物占主要部分，脂肪酸类成分包括Linoelaidic acid、Linolenic acid、Palmitic acid等，氨基酸类成分包括L-Ergothioneine、4-Acetamidobutanoic acid等，表明双孢菇提取物ABEE中化学成分复杂，化合物种类多样。
NO.2
双孢菇乙醇提取物肝脏
保护作用网络药理学研究
双孢菇提取物活性成分筛选及作用靶点获取
将上述75个化学成分通过TCMSP数据库和Swiss ADME 数据库进一步筛选，符合筛选条件的化合物共有44个，其次，将Swiss target prediction、TCMSP数据库查询有效成分作用靶点并进行筛选，将重复靶点去除，人类已证实的基因注释文件通过Uniprot数据库下载，将ABEE有效化学成分所对应的靶点进行标准名称转换，最终，得到44个化学成分符合上述条件，共有372个靶点与之对应(如表4)。其中Chrysin 对应靶点最多，属于黄酮类化合物。其次是氨基酸类、脂肪酸类化合物。
有效成分作用靶点与肝损伤相关靶点交集分析
在Gene Cards、OMIM、Pharm Gkb、TTD和Drug Bank五个数据库中检索肝损伤相关靶点，结果分别得到9101、61、178、102、5个相关靶点，进一步合并、去除重复，得到9212个肝损伤相关的基因靶点(图2A)。使用R语言程序将有效成分对应372个靶点去除重复，共得到有效成分靶点201个，与9212个肝损伤疾病相关靶点做交集，映射后获得ABEE作用靶点与肝损伤疾病靶点的共有靶点173个，并绘制韦恩图(图2B)。这173个交集靶点可能ABEE治疗肝损伤的潜在靶标。利用44个有效成分和173个肝损伤相关靶点构建“有效成分-靶点”调控网络图(图2C)。
PPI 互作网络构建及核心靶点筛选
PPI互作网络构建及核心靶点筛选通过STRING构建173个交集靶标的PPI网络(图3A)，使用Cytoscape软件对PPI网络进行拓扑属性分析，选取中介中心性(BC)、紧密中心性(CC)、度中心性(DC)、特征向量中心性(EC)、局部边连通性(LAC)、网络中心性(NC)6个拓扑属性参数，并以各自中位值作为筛选关键靶点的条件。第一次分析得到35个核心靶点(图3B)，二次筛选得到11核心的基因靶点(图3C)。调控核心靶点的对应化合物如表5所示。这些化合物可能是ABEE 发挥肝脏保护作用的关键成分。
GO和KEGG富集分析结果
对上述173个交集基因进行信号通路富集分析，将GO富集分析BP、CC、MF结果中前10个结果及其富集的靶点个数采用条形图展示(如图4A)，分析结果显示，ABEE的作用方式与脂肪酸衍生物代谢、活性氧的代谢、类固醇代谢、细胞膜作用和氧化还原过程有关。KEGG富集分析鉴定139条途径，将前10条结果采用气泡图展示(如图4D)，分析显示，化学致癌-受体激活通路所富集靶点最多，P值较小，ABEE可能是通过癌症相关通路以及氨基酸代谢相关通路发挥作用。进一步将所富集的139条通路进行二级分类(如图4B)，发现139条通路主要富集在氨基酸代谢、脂质代谢、癌症等相关通路。进一步说明ABEE可能通过脂质代谢、癌症等通路发挥作用。在前十条富集通路中挑选包含核心靶点的相关通路并采用CNET图对相关作用靶点进行展示(如图4C)。
NO.3
ABEE对小鼠肝组织病理结构的影响
为研究ABEE对CCL4诱导的小鼠肝损伤的保护作用，对小鼠肝脏组织切片并H＆E染色，显微镜下观测肝组织细胞的受损情况，探究ABEE的肝脏保护作用，如图5所示，对照组核质分布均匀，细胞质丰富，细胞核清晰，肝板、肝血窦排列规则。模型组(图5B)小鼠肝脏组织细胞出现严重病变，肝板排列紊乱，细胞核萎缩，肝细胞大面积坏死并伴有空泡化，部分肝细胞出现水变性。而与模型组相比，ABEE高剂量组(图5D)治疗后肝脏组织病理形态有明显改善，肝细胞损伤明显减轻。结果表明，ABEE对于CCL4诱导的小鼠肝损伤具有显著的保护作用。
[1]王杰，王金梅，刘慧，刘旭光，郭文静，何红平．基于网络药理学探究双孢菇的肝脏保护作用[J/OL]．食品科学.
