师法自然，溶剂交换调控的蛋白自组装胶囊。
文摘
科学
2024-04-27 21:01
浙江
编辑 | 小杨
撰文 | 小杨
Self-assembly of peptide nanocapsules by a
solvent concentration gradient本周要介绍的文章是来自于新加坡南洋理工大学材料科学与工程学院俞璟助理教授、高华健院士课题组，该文章受亚洲玉米螟蛾毛虫（Ostrinia furnacalis）角质层蛋白质的自组装能力的启发，通过一步溶剂交换过程自发形成纳米胶囊的昆虫角质层肽，其中水和丙酮混合产生的浓度梯度推动了肽的定位和自组装成空心纳米胶囊。研究发现，肽对特定溶剂浓度的内在亲和力是基本的驱动力，而水和丙酮的扩散则形成了一个梯度界面，触发了肽的定位和自组装。这种梯度介导的自组装为简单生成基于多肽纳米胶囊的给药系统提供了一种变革性途径。Biological
systems can create materials with intricate structures and specialized
functions. In comparison, precise control of structures in human-made materials
has been challenging. Here we report on insect cuticle peptides that
spontaneously form nanocapsules through a single-step solvent exchange process,
where the concentration gradient resulting from the mixing of water and acetone
drives the localization and self-assembly of the peptides into hollow
nanocapsules. The underlying driving force is found to be the intrinsic
affinity of the peptides for a particular solvent concentration, while the
diffusion of water and acetone creates a gradient interface that triggers
peptide localization and self-assembly. This gradient-mediated self-assembly
offers a transformative pathway towards simple generation of drug delivery
systems based on peptide nanocapsules.在自然进化过程中，生物体为了适应恶劣的环境，利用简单的原材料并优化其功能性质，已经发展了复杂的适应策略。其中一项策略是在生物材料的组装过程中融入功能梯度，这涉及到局部化学成分的变化、构建单元的排列以及材料内的分布。这些渐变在生物材料的各种长度尺度上都可以观察到。然而，在人工自组装系统中实现对渐变的精确控制仍是一项艰巨的任务。人工创造这类生物材料通常需要工程化渐变界面的制造，这可能是一项具有挑战性的任务。特别是，溶剂在许多自组装系统中创造这种渐变时扮演了关键角色。通过调节溶剂与组装成分之间的相互作用，可以形成一系列纳米级结构，如粒子、纤维、膜，它们展现出动态和非平衡特性。尽管这些都很重要，但这些组装过程的潜在机制往往并不十分清楚。纳米沉淀是一种常见的溶剂介导的自组装技术，通过使用混合溶剂来指导基于沉淀的自组装，从而生产聚合物纳米粒子。该技术涉及向聚合物溶液中加入过量的劣质溶剂，触发固态聚合物纳米粒子的形成过程。在此，我们描述了一种创新的策略，利用浓度梯度介导的自组装，在仿生功能化自组装肽的设计中发挥作用。利用富含保守域的昆虫外骨骼蛋白质组作为自组装肽的来源，我们已经确定了三个具有重复序列的仿生肽，这些肽可以形成中空的纳米胶囊结构，无需任何外部模板。纳米胶囊的形成首先由含肽微滴的快速形成启动，随后是较慢的溶剂梯度介导的自组装过程。初期相分离的主要驱动力是肽对富水环境的亲和力。这些基于肽的纳米胶囊可以成为多功能的递送平台，在各种生物医学领域具有潜在的应用，如药物递送、免疫疗法和基因疗法。Screening of the insect cuticle peptides在我们的研究中，我们将昆虫外骨骼视为丰富的自组装肽的来源。昆虫外骨骼是一种复杂的分级复合材料，主要由几丁质和外骨骼蛋白组成。外骨骼蛋白在外骨骼的组装中起着关键作用，而几丁质则作为加强相。第四和第五龄头部之间的变化表明外骨骼蛋白的表现变化迅速而强烈。我们对亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)头壳进行了无标记的定量蛋白质组分析（图1a）。对亚洲玉米螟幼虫外骨骼的转录组分析揭示了来自单基因的233个外骨骼蛋白（图1b和补充表1）。与真核生物蛋白的比较分析显示，外骨骼蛋白在Gly、Ala和Val上有很大的倾斜，并对Leu、Pro和Ser有适度的偏好（补充图2）。考虑到功能上重要的外骨骼蛋白通常包含重复的结构域，如几丁质结合的Rebers和Riddiford结构域，我们对来源于外骨骼蛋白的多肽序列进行了进一步的检查。我们筛选这些序列的标准要求存在三个或更多含至少五个氨基酸的重复单元（图1c）。在此，我们能够分离出九个重复肽（图1c、d、补充图3及补充表2）。蛋白质串联重复经常不是完美的，包含被定义为间隔器的突变。在选定的肽中发现的间隔器是自然发生的结果，并非活性选择。Fig. 1 | De novo sequencing and screening of nanocapsule-forming peptides from O. furnacalis.Solvent-induced self-assembly of insect cuticle peptides我们研究了昆虫外骨骼肽（ICPs）在一种称为纳米沉淀的溶剂交换过程下的组装情况，该过程使用水和各种有机溶剂（图1e，方法和补充表3），其中选择丙酮作为劣质溶剂。五种肽，即GL33、SF32、AP36、GH42和YK34，由于在水中的溶解度低（GL33、SF32和AP36）或在丙酮和水中的溶解度都高（GH42和YK34；补充表4）而不能形成组装结构。相比之下，四种肽，即WA30、NS36、VV30和QH33，形成了纳米结构。我们在组装过程中引入异佛尔酮二异氰酸酯（IPDI）作为交联剂，用于交联组装肽的N端和C端（图1f和补充图4和5a），这可以保持肽组装在水环境中的完整性。肽NS36、WA30和VV30展示出可通过溶剂调节的二级结构和在混合溶剂中合适的溶解度（补充图6和7）。我们假设，这一特性将使通过调节肽-溶剂相互作用来调控这些肽的组装成为可能。有趣的是，我们发现通过在组装过程中改变水和丙酮的体积比，可以诱导这三种肽形成中空纳米胶囊。据我们所知，没有文献报道过在纳米沉淀中不使用模板生成肽纳米胶囊。与此相反，肽QH33形成了实心纳米颗粒。Assembly of ICP capsules is mediated by microdropletsFig. 2 | The assembly of ICPs in water–acetone mixed solvent我们的实验观察揭示了在没有交联剂的情况下，ICP胶囊自组装过程中的两个不同的时间尺度。该组装过程以形成富含肽的微小滴状物开始（图2a）。在向肽-水溶液中立刻加入丙酮后，我们观察到NS36、WA30和VV30的液滴形成（补充表4）。结合显微镜观察和溶液浊度测量，我们确定了导致微滴形成的肽、丙酮和水的比例（图2b和补充图8）。在向肽-水溶液中引入丙酮后迅速形成富含肽的微滴，表明肽组装的早期阶段有一个快速的时间尺度的操作。随后，需要一个较长的时间尺度，持续数百秒，使肽滴状物过渡到更加类似固体的结构（图2e-i）。通过荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记的ICP的光学和荧光显微成像，我们观察到由于液滴聚合，滴状物的大小在数百秒内持续增加（图2c）。通过调整IPDI与肽的摩尔比，可以调节滴状物和胶囊的最终大小。较高的交联剂浓度会导致更小的胶囊尺寸（补充图9和10）。壁厚度会因实验参数的不同而变化，包括ICP浓度、交联剂量和丙酮与水的比例（补充图5b）。微滴的迅速形成是由ICP促成的，考虑到水和丙酮可以以任意比例混合。丙酮作为肽的劣质溶剂，使我们推测这些富含肽的液滴主要是基于水。这一假设通过使用不同程度疏水性的荧光染料得到了验证。水溶性染料罗丹明B（RhB）被发现积累在微滴中，而更疏水的FITC则保留在周围的溶液中（图2d和补充图11）。本质上，这种相分离导致的是一个逐步的过渡区域，而不是两相之间清晰界定的接口，其特征是由扩散驱动的丙酮浓度的稳定演变（图2a）。荧光显微镜观察显示，ICP微滴在初次搅拌后约6分钟内从均质液态滴状物过渡到胶囊（图2i和补充图12）。为了进一步深入了解这种微滴介导的肽自组装过程，我们使用Alexa-488标记的NS36和WA30进行了光漂白后荧光恢复（FRAP）实验（方法、图2e-g和补充图13）。光漂白后，NS36和WA30滴状物显示出近80%的荧光恢复在80秒内，表明微滴的流动状态（图2f和补充图14）。相比之下，NS36和WA30胶囊壁的荧光强度分别只恢复了27.6%和37.8%（图2h）。这表明在肽胶囊组装过程中，滴状物中的肽经历了从液态到凝胶态的过渡。β-Sheet formation promotes the assembly of ICPs为了探究相分离介导的ICP组装机制，我们使用圆二色性（CD）和衰减全反射-傅立叶变换红外光谱（ATR-FTIR）检测了组装过程中ICP的二级结构。形成胶囊的肽WA30、VV30和NS36在水中显示出不同的溶液结构：WA30表现出α-螺旋的特性，而VV30和NS36揭示了延伸螺旋和β-转角结构的混合。形成纳米粒子的QH33显示出随机螺旋结构（图3a和补充图15）。进一步的二维（2D）^1H-^1H TOCSY和^1H-^1H NOESY测量确认了这些观察（图3b、c和补充图16-19）。我们还通过原子模拟，使用来自液态核磁共振（NMR）实验的结构作为水溶分子动力学（MD）模拟的初始配置，来证实ICP的溶液构象。模拟得到的肽配置显示出稳定的均方根偏差（r.m.s.d.）、可溶剂接触表面积和回转半径的演变，表明在与NMR实验类似的模拟时间尺度内，肽在水中的稳定性。从MD得到的配置与NMR结构高度相似（图3d和补充图20和21）。在形成肽胶囊时，ICP转变成β-折叠结构。这一点通过ICP胶囊在用硫萤素T（ThT）染色后显示的强荧光得到支持，这表明胶囊壁中存在交叉β-折叠结构（补充图22d,e）。为了监测微滴中ICP的组装动力学，我们进行了ThT测定，根据水到丙酮的比例和时间来跟踪荧光发射。在水含量（vW/vA）低于1:7的条件下，未观察到NS36的胶囊形成，并且荧光发射在时间内保持稳定（图3e）。在导致滴状物形成的条件下（1:9 ≤ vW/vA ≤ 1:8），在最初的150秒内检测到微弱的荧光，然后迅速增加，在100-200秒内达到平台期，并与肽胶囊的形成一致（图3f和补充表5）。WA30和VV30显示出类似的行为（补充图22a,c）。通过ATR-FTIR结果（图3g和补充图23-26）也确认了胶囊形成过程中β-折叠的形成，而添加交联剂并未显著改变胶囊中的β-折叠含量（补充图27）。Fig. 3 | Transition of ICP secondary structure during the self-assembly process. a, CD spectra of ICPs.Uncovering the driving forces of ICP self-assembly在溶剂交换过程中，快速的相分离发生，形成了富含水的、含有ICP的丙酮富集介质中的滴状物。这导致了一个梯度界面，其特征是丙酮浓度平滑变化（图2a）。模拟揭示了丙酮快速扩散到富含水的相中，其扩散性的量级为1×10^-5 cm^2 s^-1（补充图28和补充表6）。我们假设肽-肽之间的相互作用随混合溶剂中的变化而变化。为了研究肽初期组装阶段，我们对多种不同丙酮浓度下的众多孤立肽进行了分子动力学（MD）模拟。肽之间的最初接触是由WA30中色氨酸（W）残基之间的π-π相互作用、NS36的氢键网络，以及谷氨酸与组氨酸侧链之间的稳定氢键对（QH33）驱动的（图4a-c）。形成最初自组装所需的时间范围从数十纳秒到几百纳秒不等，这取决于丙酮浓度和肽序列（补充表7）。我们发现，较高的丙酮浓度与较长的时间尺度相关，影响肽自组装的早期阶段。此外，我们观察到，在尤其是高丙酮浓度下，肽与溶剂之间的总氢键数减少，纯丙酮中的减少尤为显著（图4d和补充图29和30）。我们的MD模拟分析了在预平衡的混合溶剂中的肽-肽相互作用。然而，肽的扩散速度比水-丙酮的扩散速度慢。在共扩散系统中模拟肽的扩散、定位和组装超出了全原子MD的当前能力。为了克服这些限制，我们采用了自由能扰动（FEP）模拟来计算肽在水-丙酮界面上的转移自由能（TFE）（方法和图4e）。我们计算的TFE对于形成纳米粒子的肽QH33显示出一致的上升，随着丙酮浓度的增加。这一趋势表明，随着丙酮渗透富含肽的富含水相，QH33在能量上处于不利状态。丙酮的侵入改变了化学环境，驱动QH33向水浓度更高的区域迁移。这种迁移最终导致QH33沉淀，符合纳米沉淀原理。我们的研究揭示了形成纳米胶囊的肽NS36和WA30行为的重要见解。这两种肽展示了具有单一井最小值的TFE景观，最小值出现在水和丙酮之间。这些能量最小值标志着肽定位的能量最优浓度。自由能差为肽自发向梯度界面的最优浓度迁移提供了驱动力，触发肽的定位并促进纳米胶囊的形成（图4f）。然而，并非所有的肽都表现出这种行为——只有那些在其TFE景观中显示局部最小值的肽表现出形成纳米胶囊的倾向。我们强调，丙酮并不严格地作为形成纳米胶囊的肽的“劣质溶剂”。相反，它在纳米胶囊的形成中起着至关重要的作用。丙酮量不足无法介导纳米胶囊的形成，而过量的丙酮则允许形成过程发生（图3e）。ICP在水-丙酮界面的定位，加上局部高丙酮浓度，促进了β-折叠结构的形成。此外，肽在梯度界面的定位阻碍了溶剂的扩散，这可能解释了在实验中观察到的微滴到纳米胶囊转变所需的百秒时间尺度。 ![]()
Fig. 4 | Exploring the driving forces of ICP self-assembly through MD simulations.ICP nanocapsule-based cytosolic delivery of drugsICP组装过程中的溶剂梯度介导机制和中空结构使其成为有效的载体，可以共同运输大型亲水生物大分子和小分子药物。亲水生物大分子如核苷酸和蛋白质，倾向于与ICP一起驻留在富含水的滴状物中。作为一种相对温和的溶剂，丙酮并未显著改变生物大分子货物的活性（补充图31）。小型疏水分子，例如在丙酮中溶解的阿霉素（DoX），可以通过溶剂交换在纳米胶囊中被浓缩和捕获，并在水中透析时最终积聚在胶囊壁上（图5a和补充图32）。所有ICP纳米胶囊的生物大分子装载效率都高于85%，包括增强型绿色荧光蛋白（EGFP）、DNA、RNA、β-半乳糖苷酶和Smac（图5b和补充图33a,b）。相比之下，小分子的装载效率高度依赖于序列（图5c和补充图33c）。FITC标记的肽纳米胶囊在HeLa细胞中的摄取通过共聚焦显微镜得到证实（图5d）。Fig. 5 | Encapsulating protein and drug by ICP capsules.MTT实验表明，ICP纳米胶囊的细胞毒性非常低，即使在400 μg ml^-1的浓度下，所有三种肽的细胞存活率也超过90%（图6a）。WA30显示出最低的摄取效率，可能是由于其更大的尺寸（补充图34和35）。低细胞毒性以及显著的摄取效率在NS36胶囊的U2OS和MCF7细胞中得到确认（补充图36和37）。VV30和NS36纳米胶囊还表现出高内化效率，使用EGFP蛋白作为货物通过荧光激活细胞分选测量（图6b）。此外，ICP纳米胶囊有效地运送并释放了亲水药物阿霉素盐酸盐（DoXHCl）（图6c）。体外实验表明，肽纳米胶囊能够在低pH条件下快速释放药物（图6d和补充图38和39）。此外，对共同运输荧光标记的牛血清白蛋白（BSA）与DoXHCl进行了测试，展示了DoXHCl和BSA在溶酶体中的清晰共定位（图6e和补充图40）。这些细胞实验证明了ICP纳米胶囊的高装载和细胞内运输效率。通过对肽序列的修改，进一步使得可以运输核酸。通过组氨酸残基触发质子海绵效应，VV30纳米胶囊从溶酶体逃逸到细胞质中（补充图41）。在NS36序列的N和C末端分别引入了两个Cys残基以交联和稳定纳米胶囊结构（补充图42）。此外，将三个Asn残基替换为Lys以诱导质子海绵效应并减小胶囊尺寸（补充图43）。在C末端添加了RGD序列以增强细胞识别（图6f,g和补充图44和45）。序列修改的CC-N3KS-CC-RGD纳米胶囊与NS36纳米胶囊相比，展示了改善的递送深度，并成功地将EGFP质粒和mRNA运送进MCF7、HeLa和U2OS细胞。对于mRNA的输送，所有三种类型的细胞都表现出超过90%的表达效率。ICP纳米胶囊的高货物装载容量和效率使其成为免疫疗法和基因疗法的一个可能有希望的平台。Fig. 6 | Intracellular drug, protein and mRNA delivery into cells using ICPs nanocapsules.我们的研究为溶剂梯度如何影响昆虫表皮肽自组装和包裹行为提供了宝贵的见解。自组装过程在不同时间尺度上运行，开始于液体状滴状物的快速阶段，随后是β-折叠形成的较慢阶段，最终导致类似固体的结构。通过使用分子动力学模拟和自由能扰动计算，我们进一步深入探讨了肽与梯度界面能量学之间的相互作用。通过溶剂交换产生的浓度梯度是纳米胶囊形成的关键驱动因素。我们的转移自由能景观计算揭示了ICP定位和自组装背后的基本机制。形成纳米胶囊的肽展示了独特的单井转移自由能轮廓，混合水和丙酮之间的浓度的全局最小值引导肽在梯度界面上的定位。高肽浓度促进了局部区域内β-折叠的形成，帮助纳米胶囊的固化。鉴于我们研究的局限性，我们指出了若干关键的未来研究领域。虽然确认了梯度介导的自组装与自由能轮廓的联系，肽序列与其能量轮廓之间的关系仍不明确。未来的工作可以致力于建立肽序列到组装设计的通用原则。此外，我们的全原子MD模拟提供了对初始肽相互作用的见解，但无法捕捉β-折叠的形成。未来的研究可能采用粗粒化MD、蒙特卡洛模拟甚至连续模型来克服这些限制。尽管有这些挑战，我们的研究展示了一种直接的溶剂交换方法和肽筛选策略，使基于溶剂化自由能调控可以包裹多种货载。通过序列设计，我们已经操纵了肽的相态和组装行为。同样地，自然系统中浓度梯度的存在可能在指导生物界面上蛋白质的组装和组织中起到关键作用。此外，我们已经展示了ICP纳米胶囊在靶向治疗和药物输送方面的潜力，强调了我们的发现在纳米医学、生物材料和可持续制造中的相关性。
