编辑 | 小杨
撰文 | 小杨
文献信息：
Microfluidic Assembly of Degradable, Stereocomplexed Hydrogel Microparticles
JACS（2024 May）
本周要介绍的文章是来自于Duke University的Matthew L. Becker课题组。Matthew L. Becker领导的跨学科研究团队专注于开发能够解决化学、材料科学与医学交叉界面上未满足的医疗需求的生物活性聚合物。
Becker教授的突出贡献赢得了许多荣誉，包括2019年美国化学学会颁发的Carl S. Marvel Creative Polymer Chemistry奖和2015年的Macromolecules-Biomacromolecules Young Investigator奖。同时，他也是Kavli Fellow以及美国发明家国家学院、英国皇家化学学会、美国医学与生物医学工程学会和美国化学学会的成员。文章采用Stereocomplex技术，通过PLLA和PDLA链的交替排列自组装，这些链通过偶极-偶极相互作用和氢键紧密排列，达到交联的目的，制备出一种生物相容可降解的PLA水凝胶微球，其双链结合手段值得借鉴。
正文内容
水凝胶微粒（HMPs）作为生物材料应用中对传统大块水凝胶的有益替代品，其研究日益增加。对于组织工程和生物打印而言，大块水凝胶由于其聚合物网络固有的性质而受到限制。HMPs规避了这一问题，允许无论化学组成如何，都可以控制包装密度、孔隙率、异质性和可注射性。微流体方法、电喷雾和批量乳液等技术已被用于在微米尺度下生产HMPs；其中，基于液滴的微流体技术是制造球形HMPs的一种特别有吸引力的方法，因为该方法具有可重复性和尺寸/形状控制能力。通常情况下，水包油微流体系统形成溶解的水凝胶前体滴，其直径由流速和通道几何形状控制。然后通过交联/网络形成将这些滴固定成特定形态。
当前最先进的技术采用光引发的共价交联方法，使用丙烯酸酯或硫醇-烯共轭来形成水凝胶网络。光引发交联允许在温和条件下以极短的反应时间完成，具有高时空控制能力，既可以控制交联密度，也可以控制生物活性种类的锚定。然而，有毒的光引发剂和UV光对细胞活性不利，这限制了直接与细胞接触的应用。更重要的是，网络内形成的强共价键限制了HMPs的可降解性，防止了由再生组织完全替换支架。与此同时，通过热交联、客主交联和离子交联制备的完全可降解的物理交联HMPs，虽然可降解，但这些交联方式单独产生的材料缺乏许多生物打印应用所需的机械性能。这些问题提出了对一种全降解、生物相容的HMPs交联方式的需求，这种方式还需健壮、可控，并且与当前的制造方法相一致。
一种保持机械强度和可降解性的物理交联独特方法是通过立体复合（Stereocomplexed, SC）。SC是一种立体特异性交互作用，其中两种异构聚合物在混合时以特定的化学计量比形成密集的晶体区域。这种晶体区域的形成显著增加了聚合物的热性能和机械性能以及水解降解时间。聚乳酸（PLA）是一种生物相容且可降解的聚合物，自Ikada等人发现以来，就一直是立体复合的研究热点。通过沉淀聚左旋乳酸（PLLA）和聚右旋乳酸（PDLA）（1:1摩尔比）的溶液，SC领域通过PLLA和PDLA链的交替排列自组装，这些链通过偶极-偶极相互作用和氢键紧密排列。具有PLLA/PDLA功能化的亲水聚合物可以利用这种交替组装来创建锚定在SC领域的亲水网络。
虽然通过SC交联已经合成了大块水凝胶，但许多缺乏添加生物活性种类的化学功能性，限制了它们的治疗范围。最重要的是，目前尚无报告显示SC-HMPs，这可能是由于与当前HMPs制造方法的不兼容。在这里，我们报告了一系列通过微流体和晶体驱动自组装制造的可降解SC-HMPs，并展示了它们可以在组装前或组装后进行功能化。
结果与讨论
两种互补的异构聚合物水凝胶前体通过采用基于结晶性驱动的立体复合(SC)可重复地组装成水凝胶网络。图1a展示了以四臂聚乙二醇（PEG）大分子引发剂为基础，通过有机催化的环开聚合（ROP）合成左旋乳酸生成的异构聚左旋乳酸（PLLA）（每臂的DPn = 20）（PEG-PLLA）星形聚合物。同样地，合成了2-（丙炔基-1-氧基）-丙烷-1,3-二醇（化合物3）(34,35)，并用作异构右旋乳酸ROP的双功能引发剂，产生与PEG-PLLA星形聚合物链长相等的PDLA（每臂的DPn=20）（Pr-PDLA）（图1b）。在每种情况下，产率几乎是定量的。通过1H NMR光谱（图S2和S5）和MALDI-TOF（图S6）确认了分子质量。使用有机催化剂DBU在乳酸单体的环开过程中保持了手性，产生了用于立体复合所需的高异构性。（36,37）这些材料作为SC-HMPs的前体。为了形成球形网络，溶解的前体通过基于滴的微流体来塑形，其中流速控制水分进入聚合物相，同时触发疏水性SC PLA的组装和控制HMP尺寸。我们假设这一扩散过程，连同低分子量PLLA/PDLA的使用，确保了与具有相同手性的PLA链之间较弱的同质晶体（HC）领域相比，SC领域的优先形成（图1c）。
Figure 1. Synthesis of (a) isotactic poly(l-lactic acid) functionalized 4-arm poly(ethylene glycol) stars (PEG-PLLA) and (b) propargyl-functionalized isotactic poly(d-lactic acid) cross-linker (Pr-PDLA) via ring-opening polymerization of l- and d-lactide, respectively.
SC HMPs的微流体组装
在微流体芯片中，HMPs的立体复合驱动网络形成由于PLA SC的疏水性质而迅速发生。为了避免形成不明确的聚集体，在暴露于水和网络组装之前，必须在共有的良好溶剂中形成水凝胶前体的球形滴液。为了实现这一点，我们首先使用了PDMS微流体装置来促进稳定的有机-油（Organc/Oil）乳液滴液的形成。
分散相由异构聚合物前体，PEG-PLLA和Pr-PDLA，（10 wt %）在乙酸乙酯中组成。在预溶解过程中，网络基础PEG-PLLA和交联剂Pr-PDLA按1:2的比例混合，以获得理想SC所需的PLLA/PDLA 1:1摩尔比。虽然其他HMP方法使用分开的水凝胶前体溶液，这些溶液在微流体通道内混合，但我们的组装机制提供了预混分散相的便利。由于PLLA/PDLA的比例直接影响对SC的控制，这种预混合是必要的，以减少潜在的化学计量不平衡。
分散相通过由轻矿物油和Span 80（3体积%）作为表面活性剂组成的连续相聚焦成滴液。通过这种有机-油配置，可以通过射流方式常规实现稳定的滴液形成。在初步研究中，随后将滴液收集在装有去离子水的试管中进行离芯凝胶化。如前所述，去离子水作为反溶剂，通过沉淀刺激SC形成，同时也允许乙酸乙酯和HMPs的膨胀同步去除。不幸的是，使用这种方法，发现收集的滴液会结合并形成连接的HMPs链。进一步的调查显示，聚集发生在出口管的底部，有机物从液滴中扩散出来，沉淀到水中诱导快速凝胶化。由于油和水的密度差异和不相容性，油会在管道末端的接合处积聚，造成流动瓶颈，允许滴液在完全凝胶化之前聚集。
为了规避结块，引入了一种含有聚乙烯醇（PVA）（9 wt %）的去离子水作为第二连续相（图2），在流动中创建有机-油-水（Org/O/W）的“双重乳液”。PVA在水相中降低了表面张力，允许在出口管道末端流动持续，这阻止了滴液与油聚集和结块。我们假设PVA，作为一种常见的聚合物表面活性剂和双重乳液微流体的粘度调节剂，有助于减缓水分进入有机物的扩散并增加水凝胶前体的SC和随后的凝胶化。单独使用水或PVA的较低浓度通常会导致过早的SC形成和微流体芯片堵塞。
Figure 2. Microfluidic fabrication of SC-HMPs. PDMS microfluidic chips on glass were used to direct the flow of three different phases into an organic-in-oil-in-water (Org/O/W) double emulsion.
一旦实现了稳定的滴液形成，就调查了对HMP尺寸和尺寸分布的控制。油和水连续相的流速分别保持在23.0和32.0μL/分钟。在分散相流速在0.9至2.0μL/分钟之间，实现了稳定的射流状态，最慢和最快流速之间滴液尺寸发生了显著变化（图3a）。分散流速为0.9、1.2和2.0μL/分钟时，生产了一致的球形HMPs，平均尺寸分别为33.7 ± 0.5、62.4 ± 0.6和105.7 ± 0.8微米（图3c）。这些尺寸非常适合颗粒状水凝胶组装和生物打印应用。SC HMPs略显不透明，这很可能是由于半晶态交联造成的；一些SC HMPs似乎具有球形不均匀性。经过冻干处理的微粒，这些不均匀性表现为球形表面的凹痕，这在双重乳液系统中已经观察到，并且被用于捕获和传递细胞。未来的工作将集中于控制和利用这些特征进行细胞传递。
Figure 3. Microfluidic Control of SC-HMPs diameters.
立体复合HMP的表征
通过差示扫描量热法（DSC）首先评估了HMPs的结晶驱动自组装和立体复合（SC）。PEG-PLLA展示了两个弱的、低温的热转变，而Pr-PDLA展示了一个Tg = 34°C。同时，HMPs的DSC热谱图显示出一个明显的放热峰（Tc = 37°C）和一个高温熔融吸热峰（Tm = 159°C），这些在异构聚合物前体中并未出现（图4a）。已显示SC领域的形成会增加热性能，因为增加了氢键和偶极-偶极相互作用，允许领域密集地打包。因此，这些较高热转变的出现表明了新的半晶态领域的形成。应该注意的是，本研究观察到的熔点温度低于SC-PLA的文献值（Tm,SC = 220°C）。这种减少归因于PLA链端的相对短长度，因为Tm,SC预计会随着DPn和分子质量的减少而降低。此外，观察到的SC-HMPs的Tm与Pr-PDLA的降解温度（Td,5% = 158°C）紧密对齐。循环至更高温度的DSC实验显示，尽管聚合物前体经历了显著的降解，但HMPs的热稳定性增加，这进一步表明HMPs内部发生了立体复合。
Figure 4. Thermal and scattering analyses of stereocomplex formation within HMPs, swelling studies of SC HMPs, and Fluorescence microscopy images of A) FITC-functionalized SC HMPs via UV/LAP exposure and control SC HMPs with no LAP/UV exposure and B) phenyl-functionalized SC HMPs made with Ph 2 -PDLA and control SC HMPs made with Pr-PDLA.
SC领域由等摩尔的PLLA和PDLA链交替以31螺旋确认形成一个三斜晶胞。HMPs呈现出与聚合物前体不同的衍射模式，2θ = 12.2, 21.2, 24.2°的较强衍射峰对应于SC-PLA的（110）、（300/030）和（220）面，以及一个较低强度峰在2θ = 14.9°。这些衍射模式表明HMPs内存在高比例的SC领域，也有少量不太优先的HC领域存在，这是低分子量PLA所预期的（图4b）。微粒的大小似乎不影响这些组装体观察到的晶体度（表1）。
表1 Thermal and X-Ray Scattering Analyses of HMPs
为了进一步探索该系统中的立体复合作用，对冻干后的SC-HMPs的每个尺寸分布进行了SAXS测试。2D SAXS图案展示了宽广的各向同性环，这表明了一个随机排列、无序的系统。图4c展示的方位平均化1D图案中每个都包含一个在q ≈ 0.07 Å–1位置的宽散射峰，与多孔凝胶系统一致。这个特征的d间距（表1）与网络网格尺寸相关，并且在三种SC HMPs尺寸中并没有大的变化。每个粒度的对应WAXS数据（图4b）在低q区域显示出一个d间距约为1.5 nm的峰。这些特征可能是来自立体复合交联的散射，并且由于在SAXS中观察到的缺乏周期性排列，它们可能表现为在非晶PEG基质中的孤立领域。最终，观察到的晶体性质似乎不随粒子大小变化。
在该系统中确认了立体复合作用后，合成了只具有同晶体交联（HC HMPs）或非晶未交联链端（Am MPs）的微粒。要制造HC HMPs，合成了与Pr-PDLA相同DPn的Pr-PLLA，并使用与60 μm SC HMPs相同的制备和纯化过程与PEG-PLLA结合。类似地，通过在分散相中替换非同构的PEG-PLA和非同构的Pr-PLA，并且在60 μm SC HMPs制造过程中，制造了Am MPs。经冻干和DSC分析后，HC HMPs显示出明显的结晶放热峰和熔融吸热峰，表明材料中有半晶态领域。然而，与SC HMPs相比，HC HMPs展示了较低的熔点温度（Tm = 68°C），这是由于HC领域较弱的热性能所预期的。Am MPs的DSC也表现如预期，由于非晶态PLA的本质，没有热转变，表明PEG-PLA星形和Pr-PLA交联剂之间没有交联/网络形成。这种非晶性本质进一步通过Am MP的WAXS迹象中看到的大型非晶晕环得到证实（图S19）。HC HMPs显示出一个与非同构PEG-PLLA和Pr-PDLA前体相似的宽散射图案。根据SAXS，微粒网格的散射仅在SC和HC HMPs中出现，这进一步表明在这些系统中而不是在Am MP系统中形成了网络（图S20）。总的来说，与HC HMPs和Am MPs相比，SC HMPs证明具有更强的晶体性和热性质，这与以前基于SC的系统所预期的一致。（54,55）由于晶体性对于该系统的网络形成和稳定性至关重要，SC HMPs的结果表明比HC HMPs和Am HMPs具有更健壮的网络。
膨胀效果
虽然在所有尺寸分布的热分析和X射线散射分析中立体复合作用似乎相似，但SC-HMPs的网络行为似乎随尺寸变化而变化。通过将冻干HMPs的平均直径（Ddry）与在2小时和24小时时的膨胀HMPs直径（Dswollen）进行比较来确定膨胀（式3）。SC HMPs经过冻干后保留了它们的球形形态。在2小时时，100 μm HMPs达到了最大膨胀的51.5%。有趣的是，60和30 μm的HMPs在2小时时没有观察到膨胀的均衡，但分别达到了更高的膨胀62.7和77.0%（图4）。预计由于表面积与体积比的差异，尺寸之间的膨胀速率会有所不同。膨胀百分比对于最小尺寸分布的SC-HMPs来说是最大的，并随着HMP的尺寸增加而减少。这一意外的趋势可能归因于水的扩散速率根据滴液大小不同。由于沉淀迅速诱导立体复合作用，更多的局部立体复合领域可能会形成，而不是在HMP中均匀分布，从而导致不同数量的交联，但晶体相同体积分数。然而，目前正在进行进一步的研究来表征这种行为。最后，每个尺寸分布的膨胀HMP直径与在冻干前的膨胀直径24小时进行比较，以衡量干燥过程后的尺寸恢复情况（式4）。所有尺寸分布的SC HMPs都显示出在尺寸和形状上高度的可恢复性（表2）。
表2 SC-HMP膨胀行为
HC HMP和Am MP样品的膨胀行为也进行了表征。与SC HMPs一样，HC HMPs在冻干和膨胀后仍保持其形态，尽管膨胀百分比和24小时后的恢复率稍低（表2）。这些减少可能是由于与SC HMP样品相比，HC HMPs中PLLA链端之间的链间相互作用增加，而SC HMP样品则更倾向于更稳定的、离散的1:1 PDLA/PLLA SC相互作用。Am MPs的膨胀行为无法恰当地表征，因为它们在冻干后并未保持其形态。干燥的Am MPs看似融合成小团块，在膨胀后成为均质的块状结构。这个结果表明，SC和HC HMPs是由于半晶态网络交联而形成了真正的凝胶网络，而非晶态MPs则是在制造过程中被简单沉淀出来的物理捕获结构。
前/后装配偶联
虽然使用基于PEG的网络提供了高度可重复且可扩展的材料，但PEG缺乏促进细胞粘附和增殖所需的固有信号分子。合成基材料通过偶联各种信号肽如RGD（56）和YIGSR等来克服这一障碍，具体取决于细胞类型/应用。交联剂中的丙炔基官能团提供了一个功能手柄，用于通过硫代炔“点击”反应来偶联含硫肽、药物和其他生物活性物种。选择荧光标记的FITC-PEG-SH作为HMPs成功偶联的模型物种。将HMPs浸泡在含有LAP光引发剂的FITC-PEG-SH溶液中，并暴露于UV（365 nm）下30分钟，以确保深入网络中炔烃的消耗，因为较短时间内未导致荧光。与未经LAP/UV曝光的对照HMPs相比，通过荧光显微镜确认了FITC-PEG-SH的偶联（图6a）。
硫代炔“点击”化学证明是一种将水溶性物质在装配后偶联的简便方法；然而，这种策略仍然需要有害的光引发剂和UV光，而这可能在细胞已经被整合入网络的阶段。为了展示这一系统的可调节性，在胶凝开始或之后避免使用UV光的前装配功能化，对Pr-PDLA交联剂进行了前装配功能化。将2-苯乙基硫醇、Pr-PDLA和光引发剂2,2-二甲氧基-2-苯乙酰苯乙酮（DMPA）溶解在THF中，并暴露于UV（365 nm）下1小时，以产生完全消耗炔烃的Ph2-PDLA。通过用Ph2-PDLA替换Pr-PDLA并使用与60 μm SC HMPs相同的制造条件，制造了苯基功能化SC HMPs。使用荧光显微镜成像苯基功能化SC HMPs的荧光，而未功能化的SC HMPs不发光（图6b）。
这一系统的前后功能化能力为广泛应用打开了大门。此外，这种可调节性允许在有机和水性条件下进行功能化。未来的工作将探索表征和调整生物活性物种的加载效率和释放。
结论
HMPs是组织工程和治疗性递送领域迅速增长的技术。然而，现有的共价交联HMPs缺乏一个强大的物理交联替代品。在这里，我们首次报道了通过微流控技术和基于晶体驱动的自组装制备的立体复合水凝胶微粒。这种方法通过调节分散相流速来控制HMP大小。此外，网络中位于的丙炔基手柄为生物活性物种的前/后装配添加提供了机会。将来的研究将通过仔细分析网络形成和SC交联位置，对不同HMP尺寸范围之间的不同膨胀行为进行研究。此外，将专注于聚合物前体与网络行为之间的结构-性质关系，特别是尝试调节生物活性物种的降解和递送。
制备方法
材料
左旋乳酸和右旋乳酸则购自Corbion（荷兰阿姆斯特丹），经过重新结晶，并转移到手套箱中。羟基末端4臂聚乙二醇（PEG-OH）（分子量5 kDa）由Creative PEGworks购买。荧光素-聚乙二醇-巯基（FITC-PEG-SH）（分子量1 kDa）由Biopharma PEG购买。1,8-二氮杂双环[5.4.0]十七烷（DBU）在无水氢化钙上搅拌过夜，经蒸馏、冷冻抽真空循环脱气后转移到手套箱中。无水溶剂则使用Pure Solv MD-3溶剂净化系统干燥。
4臂PEG28-PLLA20 (PEG-PLLA) 环开聚合方法
在手套箱中，通过共沸蒸馏干燥的4臂PEG-OH（1.00当量）和左旋乳酸（40.00当量）在无水二氯甲烷中溶解（乳酸0.25 M），于100 mL Schlenk瓶中。接着，向反应中加入DBU（0.40当量），封口瓶并从手套箱中移出。反应在室温下搅拌2天，用苯甲酸猝灭，并在己烷中沉淀两次，得到白色聚合物。（产率98.1%，4.14 g）1H NMR（CDCl3）：δ 1.58（中强度, -CHCH3O-），3.64（中强度, -OCH2CH2-），5.17（中强度, -CHCH3O-）。13C NMR（CDCl3）：δ 16.6（-CHCH3O-），64.4（CCH2O-），66.6（-CCH2O-），69.0（-CHCH3O-），70.5（-OCH2CH2-），169.6（═OCHCH3-）。Tc = 11 °C, Tm = 56 °C, Td,5% = 191 °C。Mn,NMR = 3012 g/mol，Mn,MALDI = 3261 g/mol。
Pr-(PDLA20)2 (Pr-PDLA) 聚合方法
在手套箱中，2-(丙炔基-1-氧)-丙烷-1,3-二醇（3）（1.00当量）和右旋乳酸（20.00当量）在无水DCM中溶解（乳酸浓度0.25 M）。接着，加入DBU（0.20当量），密封反应并从手套箱中取出。反应在室温下搅拌2天，用苯甲酸猝然沉淀，并在己烷中沉淀两次，得到灰白色聚合物。（产率99.2%，1.97 g）1H NMR（CDCl3）：δ 1.58（中强度, -CHCH3O-），2.47（-CH2CCH），4.24-4.34（中强度, -OCHCH2O-，-CH2CCH），5.15（中强度, -CHCH3O-）。13C NMR（CDCl3）：δ 16.6（-CHCH3O-），20.8（-CHCH3OH），57.7（-CH2CCH），63.5（-OCHCH2O-），63.90（-OCHCH2O-），67.0（-CHCH3OH），69.3（-CHCH3O-），73.8（-CH2CCH），79.2（-CH2CCH），169.9（═OCHCH3-），175.4（═OCHCH3OH）。Tg = 34 °C, Td,5% = 158 °C。Mn,NMR = 10,800 g/mol，Mn,MALDI = 10,082 g/mol。
微流体器件制造
按照标准协议使用定义明确的流动模式制造了聚二甲基硅氧烷（PDMS）芯片。使用标准光刻工艺制造含有正性微流体通道的硅模具。涂上PDMS (Sylgard 184) 并在65 °C下固化2小时后，将PDMS芯片从硅片上剥离，然后使用1 mm活检冲孔器打孔形成进出口孔。最后，通过等离子体处理将PDMS通道和玻璃滑片粘合，形成完整的微流体设备（图S8）。
微流体组装SC HMPs
分散相由10 wt % PEG-PLLA/PrPDLA（2:1 摩尔比）的溶液组成，溶解在乙酸乙酯中。连续相1由3 vol % Span80在轻矿物油中组成。连续相2由9 wt % 聚乙烯醇（PVA）在去离子水中组成。通过分析用玻璃注射器（Hamilton，500 μL）装载和分派分散相液体。连续相则使用塑料注射器装载和分配（BD，5 mL）。聚乙烯管（内径0.023英寸×外径0.038英寸，PE-50，Warner Instruments）用于将所有阶段的液体输送至微流体芯片以及从中引出。通过注射泵（Harvard Apparatus，Pump33DDS）精确控制流速，设定分散相流速为0.9、1.2和2.0 μL/min，连续相1为23.0 μL/min，连续相2为32.0 μL/min。各阶段的流动顺序分别为：连续相1，连续相2，和分散相。滴形成实时通过BZ-X700系列数字荧光显微镜（Keyence，IL，Itasca）监测。所有带滴液体通过出口管从设备中流出，其中出口管浸没于装满去离子水的小瓶中。收集小瓶盖好并置于冰箱中过夜，以确保HMPs获得最大程度的膨胀和立体复合。
微流体组装同质晶体HMPs（HC HMPs）
按照微流体组装SC HMPs的协议进行，以下为所作改变。分散相是由10 wt % PEG-PLLA/Pr-PLLA（2:1 摩尔比）的溶液组成，溶解在乙酸乙酯中。分散相设置为1.2 μL/min的流速。按照1.2 μL/min分散速度制造的HMPs的净化协议进行。
非结晶性MP（Am MP）
按照微流体组装SC HMPs的协议进行，以下为所作改变。分散相是由10 wt % 无规聚乙二醇-聚乳酸/无规-PrPLA（2:1 摩尔比）的溶液组成，溶解在乙酸乙酯中。分散相设置为1.2 μL/min的流速。按照1.2 μL/min分散速度制造的HMPs的净化协议进行。
HMP清洗与尺寸测定
取得HMPs（每种流量5次收集）放至15毫升的离心管中，以800×g离心5分钟。彻底移除水层和油层后，重新填充去离子水并进行涡旋。此过程重复5次，以去除生产过程中的有机物或杂质。根据分散相的流速使用大小适当的细胞滤网（PluriSelect, El Cajon, CA）过滤HMPs。以0.9 μL/分钟的流量制造的HMPs通过40 μm的细胞滤网进行过滤。以1.2和2.0 μL/分钟的流量制造的HMPs分别通过40至70 μm和85至150 μm的细胞滤网进行过滤。使用BZ-X700系列数字荧光显微镜获取每次收集的图像，并通过ImageJ软件分析来测量HMP直径（每次收集50个）。
示差扫描量热法（DSC）
DSC使用TA Instruments Discovery DSC250系统（TA Instruments-Waters L.L.C., New Castle, DE）进行。样品（2-5毫克）使用压封铝盘准备。样品经过10°C/分钟的升温/降温速率，从-10°C到180°C进行测试。玻璃化转变温度（Tg）从第二次升温循环中转变的中点确定。结晶温度（Tc）和熔化温度（Tm）分别从第二次升温循环中的最大和最小的转变值确定。
广角X射线散射（WAXS）与小角X射线散射（SAXS）
SC HMPs及其前体的WAXS/SAXS在SAXSLab Ganesha系统上进行，系统配有铜50 kV Xenocs Genix ULD SL X射线点源和170毫米像素间隔的单光子计数Dectris Pilatus 300k 20Hz探测器。实验在2缝隙配置下进行，样品与探测器的距离大概是WAXS测量101毫米，SAXS测量1041毫米。Am MP和HC HMP以及所有毛细管WAXS/SAXS在SAXSLab Xeuss 3.0系统上完成，系统配备铜50 kV Xenocs GeniX X射线点源和Dectris Eiger 2R 1M像素的二维探测器。样品与探测器的距离大概为WAXS测量45毫米，SAXS测量900毫米。WAXS数据的一维平均通过线性x轴分箱对所有角度进行平均完成。光谱的逐一减少和对样本透射、样本厚度和绝对强度因素的校正都包括在内，使用saxsgui软件v2.23.33进行一维平均。
为了准确确定WAXS光谱中峰强度对应的动量转移，该图案使用Fityk软件建模。用点在8和25°处进行拟合的样条线平整基线。使用六个高斯分布来对WAXS模式进行解卷积，利用Levenberg-Marquardt算法来最小化残余。其中四个高斯用来模拟晶体衍射峰，其中一个代表小量杂质并没有用于计算结晶度。两个高斯分布模拟非结晶贡献。这些高斯的面积总和用来根据公式1计算结晶度，其中A代表总的结晶或非结晶区域。
对SAXS数据进行洛伦兹修正，以便更容易拟合。这是通过将强度导数与其相应的动量传递平方相乘来实现的。修正后峰值中心未移动，因此，在Fityk中使用样条基线和一个高斯模型来对修正后的数据进行建模。这个高斯的中心被用来根据公式2计算d间距，其中q是高斯的中心。
膨胀研究
HMPs（每种流速3次收集）进行冻干处理，然后在1×PBS（pH 7.4）中于37°C孵育。在冻干后和孵育2小时与24小时后进行成像，以表征膨胀行为。使用BZ-X700系列数字荧光显微镜拍摄每个收集步骤的图像（冻干，2小时膨胀，24小时膨胀），并通过ImageJ进行分析，以测量HMP直径（每次收集50个）。
组装后硫醇-炔“点击”荧光标记
HMPs在450微升的1毫摩FITC-PEG-SH（1千道尔顿）DI水溶液中浸泡30分钟，然后加入50微升的0.1毫摩锂苯基(2,4,6-三甲基苯基)磷酸盐（LAP）DI水溶液。在加入LAP后，立即将溶液暴露于UV光照射（波长365纳米，10.9毫瓦/平方厘米）30分钟。对照实验在没有LAP溶液或UV暴露的条件下进行。为了清除残留的FITC-PEG-SH，用35%的乙醇对HMPs进行了过度洗涤。
Ph2-PDLA的合成
在一个大气条件下的小瓶中，Pr-PDLA（0.120克，1等量当量）和2-苯基乙醇巯基（21.3微升，4等量当量）在THF中溶解（2毫升）。加入2,2-二甲氧基-2-苯基丙酮（DMPA）（0.060克，2重量百分比）后，立即封口，涡旋，并暴露于UV辐射（波长365纳米，10.9毫瓦/平方厘米）1小时。溶液在己烷中沉积三次，真空干燥，得到一种黄白色聚合物。产率为93.8%，重量为0.123克。1H NMR（DMSO-d6）：δ 1.46（中，-CHCH3O-），2.80（中，-CHCH2S-，-SCH2CH2-），3.17（中，-SCHCH2-），3.50-3.80（中，-CH2Ph），4.00-4.30（中，-OCH2CH2-，-OCH2CHS-），5.20（中，-CHCH3O-），5.46（中，-CHCH3O-），7.25（中，-Ph）。
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