编辑 | 小杨
撰文 | 小杨
文献信息：
Systemically injected oxygen within rapidly dissolving microbubbles improves the outcomes of severe hypoxaemia in swine
Nature Biomedical engineering
本周要介绍的文章来自于哈佛医学院/波士顿儿童医院John N. Kheir和Yifeng Peng课题组，John N. Kheir是波士顿儿童医院的医生兼研究员，隶属于哈佛医学院。他的研究主要集中在心脏病学和危重症医学领域。他因开创性研究而闻名，该研究旨在开发充氧微粒，用于治疗患有危及生命的呼吸衰竭的患者。该技术旨在为无法正常呼吸的患者提供快速供氧的新方法。Kheir博士的研究在急诊医学、新生儿学和儿科护理等领域具有重要影响。Yifeng Peng, PhD 是波士顿儿童医院和哈佛医学院的研究员，专注于计算生物学和生物信息学领域，尤其是分析复杂的生物数据，以指导治疗和研究策略，尤其是在基因组学和系统生物学方面。他的研究通常结合计算模型与实验数据，以更好地理解疾病，尤其是影响心血管系统的疾病，并辅助开发新疗法。他们来自于波士顿儿童医院转化研究实验室（TRL），该实验室旨在提高儿科和成人心血管重症监护医学的护理标准。
人类细胞利用氧气来有效地产生能量和维持细胞内稳态。氧气供应不足可导致一些危重疾病中的组织损伤和死亡。组织缺氧的原因是多种多样的，包括血液氧合不足（如面部和面部引起气道阻塞的颈部创伤、吸入性损伤导致急性肺损伤和哮喘）、血流不足（如创伤性出血或心脏骤停）或氧气提取不足（如一氧化碳中毒）。许多这些疾病可导致死亡：急性呼吸窘迫综合征的~死亡率为40%，心脏骤停的~死亡率为80-90%，这突出了维持供氧的重要性。此外，这些疾病的幸存者往往会表现出严重的后遗症，如脑损伤和肾功能衰竭，即使是短暂的缺氧发作。本文章主要针对血氧合不足（即低氧血症），使氧气能够直接注入血液，以快速逆转低氧血症。
正文内容：
低氧血症，即血氧饱和度过低，通常发生在肺部疾病或气道阻塞的情况下，导致血液在经过肺部后未能充分重新氧合便进入全身。在住院患者中，严重的间歇性低氧血症可能由气管插管阻塞（如分泌物）、渐进性肺损伤或其他多种原因引起。这类事件可以通过清理气道、肺部扩张、增加呼吸支持，或在必要时使用吸入性一氧化氮或体外膜肺氧合（ECMO）来解决。然而，有时低氧血症会严重到短暂且对这些措施无效，导致心肌收缩功能衰竭，进而引发无脉电活动甚至心脏停搏；临床表现为心脏骤停。值得注意的是，15%至40%的院内心脏骤停（IHCA）是由呼吸功能不全引起的。这类患者往往不仅面临低氧性损伤，还伴随着缺血性损伤（即心脏活动和血流停止），导致大脑、肾脏和其他器官的严重缺血性损伤。IHCA患者的出院生存率约为20%，其中约1/3的患者存在严重的神经系统损伤。众所周知，通过在IHCA期间优化氧气输送（如高质量的心肺复苏（CPR）），并尽早恢复自主循环（ROSC）以及在CPR期间迅速接入ECMO，能够提高IHCA后的生存率。成功复苏IHCA需要快速识别并逆转其根本原因；然而，逆转顽固性低氧血症仍然是一个未解决的挑战。
通过可注射气体载体进行静脉注射氧气（IVO2）提供了一种快速提高血氧饱和度的补充机制。IVO2不同于基于全氟碳或血红蛋白类似物的血液替代品，后者是为在功能性肺单元的环境中作为循环气体载体而优化的，而非直接向血液中输送氧气。同样，输注氧合血液也不适合作为低氧血症的治疗方法，因为血液中相对较低的气体含量会需要大量输注，快速使循环系统负担过重并引发肺损伤和心力衰竭。因此，科学家们一直在寻找能够在液体中提高氧气携带能力的替代材料。
一些研究团队已经描述了包覆有磷脂或聚合物壳的微泡（MBs），用于向动物模型中输送氧气以急性逆转低氧血症。然而，将IVO2从生物材料研究转化为一种临床上可行的疗法仍面临许多挑战。主要原因是，在紧急情况下静脉注射即便是少量气体也需要解决微血管阻塞、材料相关毒性和产品可行性的问题。因此，目前尚不清楚在严重低氧血症情况下静脉注射氧气是否具有“临床”益处。本研究中，我们采用了一种理性设计的方法，开发了聚合物微泡（PMBs）作为气体载体，用于将IVO2转化为临床应用。PMBs设计为能够在生理环境中瞬间溶解，其壳体转化为可溶且可排泄的分子成分，从而实现快速输送大量氧气，而无明显的急性安全性或毒性风险。我们证明，在严重低氧性心脏骤停的动物模型中，通过PMBs注射氧气显著提高了生存率和神经功能的改善。这些发现强调了在急性严重低氧事件中维持关键氧合阈值的治疗重要性，并展示了IVO2作为一种在这种情况下具有潜在疗效的独特可能性。
气体载体设计
我们认为几项因素对于设计一种药学上可接受的气体载体至关重要。首先，载体必须在与血液接触后迅速释放氧气。其次，任何注射的颗粒必须在给药后迅速溶解，以避免血管阻塞。第三，必须尽量减少载体液体的使用，以避免体液过多。第四，载体材料必须具有低毒性，并能有效清除，以最大限度减少长期副作用。
最初，脂质包覆的氧气微泡（LOMs）似乎是静脉注射氧气（IVO2）的一个有前景且直观的解决方案，因为它们具有高度的生物相容性，气体含量高，并在有氧气“汇”存在时溶解为胶束。然而，脂质壳体通过表面重组和气体交换抑制了气泡的完全溶解，且即使在健康动物中低剂量注射LOMs后，它们也会在循环中持续存在并引发气体栓塞，从而禁止其在紧急情况下作为复苏治疗使用。为了增强气体溶解，我们最近开发了pH响应的微泡（MBs），这些微泡在储存中保持稳定，但在血液中迅速溶解，由生理pH触发。这是通过一种界面纳米沉淀（IFNP）的方法实现的，该方法形成了一个由pH响应性聚合物包裹气体核心的固态壳体。我们展示了与LOMs和其他微载体相比，IFNP MBs显著降低了急性血管阻塞的风险。不幸的是，IFNP需要使用疏水聚合物，这些聚合物必须是不溶于水的，以便在它们在有机共溶剂中预溶解后在水溶液中实现纳米沉淀。因此，在血液中IFNP MB溶解后，壳体成分会以大纳米颗粒和不溶性聚集体（>100 nm）形式存在，这随后可能由于不良的疏水相互作用和器官沉积而引发材料毒性和组织损伤。因此，我们假设，使用低分子量（MW）和更亲水的聚合物来制造MB壳体，这些聚合物在生理pH下可以转化为可溶的分子成分，从而减少非特异性生物相互作用并促进清除，能最大限度地减少材料毒性。然而，我们以前的IFNP方法无法使用水溶性低分子量聚合物构建气体载体MB。
为绕过这一限制，我们开发了一种广泛适用的pH诱导界面交联方法，使用低分子量和水溶性聚合物在水溶液中创建稳定的pH响应性PMBs，而无需使用有机共溶剂。在血液pH条件下，PMB壳体会恢复为其分子上可溶的组分，这是美国食品药品监督管理局（FDA）认可的用于最大限度降低可注射纳米材料安全风险的策略。为展示这一方法，我们首先选择了一种低分子量右旋糖酐（6 kDa）作为起始材料，并通过乙酰基和羧基（LmD）对其进行化学修饰，创建出一种pH响应的两亲分子，该分子在生理pH下可溶，但在酸性环境中不溶。为了制备PMBs，将LmD聚合物溶解在pH调节的葡萄糖溶液（pH 6.5）中，并在空气-水界面进行均质化，同时使用稀盐酸慢慢酸化混合物（目标pH约3.5）。均质化产生了气泡模板，促进了LmD在界面处的吸附，因为它具有两亲性，而LmD则通过酸诱导的羧基质子化进行交联。这个过程形成了一个薄壳（<50 nm）的MB包裹在气体核心周围。界面交联是通过分子间的氢键和其他范德华力驱动的。红外吸收数据显示，聚合物壳中的羧酸基团大部分处于键合状态，同时也有少部分未键合。
随着葡萄糖浓度的增加，PMB的产量显著提高，这可能是由于聚合物聚集的促进作用以及在较低pH下在界面处的更高密度。PMB壳显示出类水凝胶的特性，并与周围液体保持渗透平衡；在30%葡萄糖中制造的PMB用纯水清洗会导致壳体膨胀，水分涌入并替换掉气体核心；尽管如此，在30%葡萄糖中无菌制造的PMB可以用10%葡萄糖（D10）溶液清洗并储存，这是标准的临床静脉注射液体。通过调节均质化速度优化泡沫的包装密度（因此优化了气体携带能力），泡沫的最佳气体分数为62 ± 2%（气体体积/泡沫体积），平均颗粒直径约为5 μm。进一步的PMB制造细节见补充图。在某些聚合物微粒类似物的基础上，PMB薄壳具有高度气体渗透性，允许充气PMB通过氧气净化被动转换为氧气填充的PMB。氧气填充的PMB可以在室温下储存在密闭容器中，并且可以稳定储存数月。氧气填充PMB的长期稳定性通过加速稳定性测试在不同温度下进行评估。在玻璃注射器中储存的氧气填充PMB在45°C下稳定储存达30天，而在60°C下观察到氧气填充PMB的损失。基于这些结果，我们预计氧气填充PMB的保质期在室温下至少为6个月，在冷藏条件下至少为1年。在进行体内使用前，确保每批制造的PMB保持无菌性。为了展示该系统的材料可调性，我们还展示了使用低分子量羧基化羟乙基淀粉聚合物制备PMB的应用。
图1：乙酰基和羧基修饰的聚合物氧气微泡用于静脉氧注射治疗
PMB的体外溶解
静脉注射气体需要气体载体快速溶解，以避免血管阻塞。随后，载体材料必须具备生物相容性并能迅速清除。如前所述，LmD聚合物本身由于含有羧酸基团（pKa 约为 4.8）而在溶液中表现出pH响应行为，并且在pH 5以上时分子上是可溶的。在本研究中，PMB注射后的溶解机制依赖于基于pH的羧基脱质子化，这增加了构成壳体的聚合物的溶解度和水合作用。这导致水分渗入壳体，增加表面张力并使气体核心不稳定，促进其溶解。同时，脱质子的壳体恢复为小的、可溶的成分。值得注意的是，与需要气体浓度梯度（即“汇”）才能溶解的脂质包覆气泡不同，PMBs即使在没有氧气“汇”的情况下，也能在生理pH值下数秒内溶解。为了验证PMB壳体是否完全溶解并恢复为可溶的LmD成分，我们将PMBs加入不同pH值的磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液中，并通过动态光散射（DLS）测量在混合后2分钟内的大小（由于仪器的采样限制，无法获取更早的时间点数据）。在pH 9.0至5.0之间，PMB壳体在2分钟内完全溶解，恢复为与从固态制备的LmD溶液中相似的可溶性聚合物。溶解的LmD聚合物的平均水动力半径小于10 nm，估计分子量为约12 kDa（通过核磁共振确定），远低于肾小球过滤的分子量截止值（30–45 kDa）。相比之下，先前由高分子量疏水聚合物（>60 kDa）组成的IFNP MBs溶解后会形成大且不溶的纳米颗粒（>100 nm），这些颗粒随时间明显沉淀。
图2：乙酰基和羧基修饰的聚合物氧气微泡在生理环境中快速溶解
为了更好地研究pH依赖的溶解动力学，我们将PMBs与PBS混合，同时持续施加超声波。类似于其他聚合物壳体的微泡，PMBs的气体核心会产生声波反射，随视野内气泡存在的比例产生对比。研究发现，对比强度的减少（即气泡溶解）与pH相关：在pH 9.0、7.2和6.5时，PMBs在2–3秒内不再可见，而在pH < 6时，气泡溶解时间更长（图2b,c）。需要注意的是，尽管LmD壳体在pH 4.8和3.8时的溶解性较差，但我们观察到PMBs的气体核心缓慢充满液体，表现为回波强度的逐渐下降，这可能是由于PBS中的盐类影响了类似水凝胶的壳体的膨胀。虽然超声可能通过惯性空化导致微泡的丢失，但图2b表明pH是影响溶解速率的主要因素。为了进一步解释声波破坏的影响，我们在选择的终末时间点只施加超声波，结果显示相似的溶解速率（图2d,e）。
为了进一步探究壳体的溶解（与气体核心的溶解分开），我们进行了紫外-可见光谱分析。在这种构建中，吸光度的增加可能由未溶解的气体核心或大聚合物聚集体（即未溶解的壳体或聚集成分）引起。从pH 9.0到6.0，紫外吸光度在2–3秒内回到基线，类似于声学研究中的动力学，表明气体核心已溶解，壳体在此时间内恢复为可溶性成分（图2f,g）。在pH 5.5和5.0之间，返回基线的时间比声学研究中要长，表明在此pH范围内，气体核心首先溶解，而壳体需要更多时间恢复为可溶性聚合物。这些发现与PMBs的pH触发溶解机制一致，该机制本质上是酸碱反应，其速率与溶液中的氢氧根离子浓度成正比，并受扩散限制。这一机制也解释了在较低pH值下溶解动力学的一些差异。例如，与紫外-可见光谱相比，DLS显示在pH 5.5和5.0时PMBs在2分钟内完全溶解，可能是由于紫外-可见实验中混合不足所致。然而，在pH > 6.0时，各种方法测得的溶解动力学均表现一致。这些结果共同验证了我们对新型气体载体的设计，并证实PMBs的气体核心和壳体均能在生理相关的pH水平（7.5–6.5）下快速溶解，血液pH即使在极端情况下也很少低于6.5。
PMBs对急性血流动力学的影响
先前未表现出触发溶解机制的可注射气体载体由于注射后气泡的持续存在，会导致肺血管阻塞。任何静脉注射的液体会立即从注射部位流向右心房和右心室，然后被射入肺循环，最后返回左心以进入动脉系统。肺毛细血管是最小的血管，因此最易发生阻塞；如果气体载体中的颗粒或气体栓塞阻塞了肺毛细血管，则肺血管阻力（PVR）会增加。为了在此模型中诱发血管阻塞，我们使用了充满空气的PMBs而非氧气PMBs，因为脱氧血红蛋白的高浓度使氧气的逸出梯度超过氮气。经过基线期后，测试组大鼠（n = 4，体重503 ± 52 g）每3分钟接受5次注射，每次注射5 ml 50%体积气体/泡沫体积的D10（每次注射约2.5 ml气体），共12.5 ml空气，随后观察60分钟。对照组大鼠（n = 5，518 ± 40 g）接受等量的D10注射。注射气体含量为~1.7 ml kg−1 min−1，相当于人类基础氧气消耗的50–100%。两组在注射期间的PVR较基线有所下降，且两组之间无显著差异（PMBs组为−64.5 ± 40.1 mmHg ml−1 kg−1 min−1，对照组为−45.2 ± 27.2 mmHg ml−1 kg−1 min−1，P = 0.41），这可能反映了两组均表现出前负荷可招募的搏功增加和心脏指数的增加。类似地，两组在注射期间的平均动脉血压（MABP）均有类似增加（PMBs组为53.0 ± 20.6%，对照组为57.6 ± 21.7%，P = 0.69）。综上所述，此急性血流动力学特征表明，快速多次PMBs注射后并未发生肺部阻塞，且与快速注射脂质包覆微泡和由聚乳酸-羟基乙酸组成的气体载体的表现不同。
图3： 乙酰基和羧基修饰的聚合物氧气微泡在对应pH条件下快速释放
为了验证PMBs在体内的溶解情况，我们在注射PMBs与LOMs后进行了经胸超声心动图检查（图3g和补充视频2）。将充满空气的PMBs或氧气填充的LOMs（50%泡沫，气体体积相等）以高达12 ml 气体 kg−1 min−1的不同速率持续输注；由于较高速率会导致血流动力学崩溃，氧气填充的LOMs仅以最低速率（4 ml 气体 kg−1 min−1）输注。注射LOMs后，所有四个心腔立即变得不透明（图3h和补充视频3），显示出未溶解的LOMs经过肺部进入循环。相比之下，即使在3倍于LOMs的注射速率下，aPMBs和oPMBs在左心室中也不可见（图3i–l，补充图17和18及补充视频4和5）。与LOMs相比，在以相同速率注射aPMBs和oPMBs后，右心室的浑浊程度也较低，这为其在体内的快速溶解提供了证据。在PMB注射结束后的几秒内，右心室的浑浊现象消失，而循环中的LOMs在注射后10分钟仍可见，强调了它们在体内的持久性。综合这些数据表明，PMBs在快速注射后迅速溶解，且即使在没有“汇”的情况下也不会导致血管阻塞，同时能够输送高气体负荷。
PMBs在缺氧相关心脏骤停中的疗效
在证明PMBs的急性安全性后，我们评估了它们对临床现实中的极端缺氧呼吸衰竭和院外心脏骤停（IHCA）模型的影响（图4a）。简要而言，约克郡猪接受麻醉和设备安装，包括气管插管和动静脉导管的置入。在接受21%氧气的静脉镇静和神经肌肉阻滞观察一段时间后，猪经历了12分钟的呼吸暂停/窒息。经历心脏骤停的动物（定义为收缩压<40 mmHg超过5秒）接受高质量的胸外心脏按压CPR和节律导向的复苏干预，包括按照当前标准使用的药物和除颤。在损伤发生的第6、8和10分钟，猪随机接受IV O2（总计400 ml 35%体积氧气/体积泡沫oPMBs，含约140 ml氧气，n = 8）或相同体积的充氧D10（n = 10）。鉴于在本实验的基线期测得的平均静息氧气消耗（VO2）为73.2 ml min−1，因此该体积代表在窒息的最后6分钟提供了约30%的静息氧气消耗。经过12分钟后，气道被打开并恢复通气。CPR持续进行，最多可达30分钟或直到恢复自主循环（ROSC）。存活的动物随后在重症监护病房（ICU）环境中维持4天，包括机械通气、拔管准备测试、正性肌力支持以及根据标准化协议进行癫痫监测和治疗。在第4天，进行脑部磁共振成像（MRI），随后实施安乐死和病理分析。
图4：静脉注射聚合物氧气微泡改善严重低氧性呼吸衰竭猪生存率
oPMBs对复苏指标的影响
在各组之间的基线特征没有差异，包括年龄（oPMB组43天，控制组49天，P = 0.08）和体重（12.1 ± 1.1公斤对比12.0 ± 1.3公斤，P = 0.953）。在经历了6分钟的窒息/呼吸暂停后，相似数量的动物发生了心脏骤停（补充图19）。两组的CPR质量均为优良，压缩频率、压缩比或压缩深度没有显著差异（补充图20）。动脉氧饱和度（SaO2；每隔一分钟通过血气分析进行检测）在6分钟时降至不可检测水平（<3%），而在第9分钟时，接受IVO2治疗的猪的SaO2明显高于控制组（24 ± 14%对比4 ± 2%，P = 0.012），在第11分钟（23 ± 7%对比3 ± 1%，P = 0.017）和第13分钟（96 ± 8%对比77 ± 36%，P = 0.024；图4b）。同样，动脉血液中的氧分压（PaO2）在第7、第9和第11分钟时在IVO2治疗的猪中显著较高（补充图21）。在第7、第9、第11和第13分钟时，IVO2治疗的猪的动脉二氧化碳张力较高（P < 0.05；图4c），这可能是由于细胞代谢和CO2产生的保持（尽管这也可能部分由哈尔丹效应解释）。虽然所有猪都经历了心脏骤停，但在许多IVO2治疗的猪中，IVO2成功恢复了循环（图4d），因此CPR的持续时间（图4e）和复苏协议中指示的肾上腺素剂量（图4f）在IVO2治疗的猪中显著较低；IVO2治疗的猪在治疗期间也有明显的平均动脉血压（MABP）改善（图4g）。在解除气道阻塞后，IVO2治疗组的猪更可能达到恢复自主循环（ROSC）（100%对比30%，P = 0.003）和整体存活率（88%对比30%，P = 0.007）（图4h）。
oPMBs对器官损伤的影响
在对照组中，只有3只猪达到ROSC，且全部经历了严重的神经损伤：没有一只成功拔管，且均经历了难治性癫痫持续状态和尿崩症（这是深度脑损伤的标志现象）（补充图22）。在IVO2治疗组中，8只达到ROSC的猪中，有5只在24小时内成功拔管，并能在受伤后3天独立活动、进食和饮水（补充图22）。即使在仅存活的猪中，IVO2治疗组的猪在受伤后的第1至第3天的神经功能缺损评分（SNDS）显著较低（图4i）。胶质纤维酸性蛋白（GFAP），一种与脑细胞损伤成正比释放的脑星形胶质细胞蛋白，控制组存活的猪在第4天的水平几乎高出两个数量级（IVO2组0.3 ± 0.2对比控制组21.8 ± 12.4 ng ml−1，P < 0.001）（图4j）。在磁共振血管成像中，存活的3只控制动物均未显示任何可检测的颅内血流，并且均有广泛水肿及小脑扁桃体和脑镰疝的证据（图4k）。使用扩散成像的手动分割评估后，IVO2治疗的猪显示出显著较低的白质损伤体积（2,269（IQR 1,560–3,533）mm³）与控制组（20,784（19,154–23,556）mm³，P < 0.001）（图4k–o）。控制动物的脑损伤程度通过组织学检查显著可见（图4p和补充图23）。组织切片显示，对照组的损伤在各个区域广泛，而治疗动物的损伤显著减轻，仅在大脑皮层和基底神经节出现有限的局灶性损伤（图4p、q及补充图24）。控制组的缺氧缺血损伤评分显著高于治疗组（整体损伤评分27.7 ± 0.6对比11.0 ± 4.4，P < 0.001；图4q和补充图25）。此外，IVO2治疗的猪在血尿素氮（BUN）（图4r）、肌酐（图4s）和组织学分析（补充图26）方面显示出显著较少的肾损伤。在其他器官的损伤实验室或组织学表现方面没有显著差异（扩展数据图2和补充图27–29）。这些结果表明，oPMBs有效逆转缺氧，并通过适度增加血氧水平，显著降低心脏骤停的负担、减少死亡率并减少急性严重缺氧中的缺氧缺血损伤。
安全性研究
oPMBs治疗猪的反应良好，动物没有出现不良反应的临床迹象。为了探查PMB成分的生物分布和药代动力学，我们在健康小鼠中进行了89Zr标记的LmD聚合物注射后7天的正电子发射断层扫描与计算机断层扫描（PET/CT）成像。在进行一次尾静脉注射（400 mg kg−1，相当于猪研究中的剂量）后，大多数LmD聚合物在24小时内通过尿液排出，其余通过肝脏清除（图5a–d）。到第7天，低水平的LmD被发现于脾脏（5.9 ± 1.5%注射剂量每克）、肝脏（2.7 ± 0.7%）和肾脏（1.9 ± 0.5%）。根据经验计算，>75%的注射聚合物已被清除，剩余的主要在肠道腔中可视化（即，正在排出过程中）（图5e）。这些结果支持我们的设计假设，即使用低分子量和更亲水的聚合物大大促进了清除。为了进一步评估PMBs的潜在不良反应，我们在健康小鼠中进行了高达14天的安全性研究，尾静脉注射单剂量oPMBs（32 ml kg−1，70%泡沫，等效于上述疗效剂量，n = 12 oPMB，n = 9 D10对照），在4天、7天、14天的时间点牺牲，及在30分钟后给予双倍剂量（共64 ml kg−1，n = 3），在14天时间点牺牲；对照动物（n = 3）接受等体积的D10。在观察期间，所有动物存活且表现正常行为，正常尿液输出和体重增加（图5f）。在任何时间点，组间在血气、化学、全血计数或肝功能检测方面均无差异（图5g–o及补充图30）；没有观察到临床可见的免疫毒性或血小板功能障碍迹象。此外，旋转凝血弹性测定（ROTEM）显示，PMBs未影响内源性或外源性凝血途径，所有时间点的凝血时间、凝块形成时间、最大凝块硬度和最大溶解度均正常（图5p–w）。两组主要器官的组织学分析显示出相似的正常形态，除了观察到治疗动物中脾脏巨噬细胞的泡沫形成。这可能是由于脾脏对聚合物的摄取，趣味的是，在猪中未观察到这种现象（补充图31）。这些结果共同支持PMBs在静脉注射后转化为可溶性低分子量成分，并在临床相关剂量下耐受良好。
图5：聚合物氧气微泡在小鼠体内的分布和安全性评估
结论：
我们描述了一种具有药物可行性的气体载体设计，以实现IV O2治疗的临床转化。PMBs表现出高气体承载能力、可接受的货架稳定性以及足够的规模和控制能力，从而最终能够支持临床试验。在所描述的泡沫气体浓度（35–50 ml O2 dl−1泡沫）下，提供100 ml氧气需要共同注射100–185 ml的额外液体。与以前的注射气体载体（例如LOMs）不同，PMBs的pH触发机制在没有扩散梯度的情况下，主动增强其溶解和气体负载的输送。因此，即使在高剂量或低血流条件下施用，也能最大限度地降低血管阻塞的风险。这一特性在严重疾病和急救环境中尤为重要，因为这些环境下心输出量和血流可能瞬息万变；而其他气体载体可能会导致气体栓塞或颗粒堵塞，从而引发肺血管阻塞和心血管崩溃。
在溶解后，PMB外壳迅速转化为低分子量的可溶性成分，这一策略降低了不良的非特异性疏水相互作用，这是纳米毒性的重要原因。我们的原型LmD PMBs显示出高耐受性，并通过肾脏和肝脏排泄，显著提高了安全性，优于早期的产品。我们还展示了壳材料的聚合物结构是可调的。这些特性的结合使得PMBs成为一种新型药物设计，可能使临床静脉注射氧气成为可能。
急性严重低氧血症是危重病人常见且危及生命的事件，代表着巨大的临床挑战。它可能在气管插管、机械通气（例如由于分泌物）或气道出血的情况下发生，并且如果不立即处理，可能导致心脏骤停。当缺氧进展到临界阈值时，线粒体还原发生，细胞能量匮乏，形态学损伤，心血管崩溃随之而来。在这样的患者中，预后往往非常糟糕。我们已经证明，IV O2在短时间内打断这一致命的连锁反应，直到常规手段能够恢复正常氧合。预防此情况下的心血管崩溃是预防神经损伤的关键。大脑对氧气的需求极高，并且对氧气供应的中断极为敏感，在没有血流的情况下，15–30秒后就会变得等电，并在几分钟内造成不可逆转的损伤。在我们的研究中，对非常严重缺氧的初步反应是明显的血压和心率升高（代表交感神经系统反应），随着氧气底物的耗竭，逐渐退化为低血压和无脉电活动。
在这种情况下，静脉注氧对循环具有协同益处：（1）肺动脉局部高氧状态导致肺血管扩张，降低血流阻力；（2）提供氧气以供能量生成，恢复全身血管阻力（包括小动脉和静脉）和心肌功能，从而提高灌注压和血流；（3）聚合物外壳的残余物扩大了血管内的容量和心脏前负荷，增强了心输出量。这些效应共同维持或迅速恢复缺氧相关心脏骤停情况下的循环。此外，我们还发现，达到这些效果所需的氧气剂量仅为健康人基线消耗的一个小部分。在严重疾病状态下，如重度缺氧，氧气消耗变得受供应限制，因此给予一定剂量的氧气可能对细胞代谢产生更长久或更明显的影响。此外，在肺损伤的临床环境中，给予的氧气剂量可能也会产生更显著的影响。通常情况下，氧气从肺泡流入血液，但在这种气道阻塞模型中，肺动脉的氧气张力超过了肺泡，因此氧气最初向后扩散，平衡肺的功能残气量（即增加气体负载的分布量）；从这个意义上说，这是一种通气-灌注不均的夸大模型，这在临床肺病患者中是一个中心病理。我们预计这种向后扩散的现象将在通气-灌注不均更为异质的患者中减轻，因此剂量反应将更为明显。总的来说，这些发现突显了IV O2作为一种新型治疗方法在急救环境中快速逆转危及生命的缺氧的独特药理学优势，包括院前、ICU和手术室环境。我们承认，虽然我们在窒息性心脏骤停模型中展示了益处，但这种益处是否会在其他严重缺氧模型（例如肺损伤）中复现仍需使用不同动物模型进行实验验证。
在临床实践中，我们设想IV O2将在护理危重患者时可随时获取。由于在风险患者中，动脉氧饱和度通常通过光电容积描记法进行持续监测，IV O2可能成为治疗难治性低氧血症的新手段，即对目前护理标准（如气道清除、肺复张和其他关键措施）无效的低氧血症。其剂量可以像治疗难治性低血压的预先注射肾上腺素的剂量一样进行调整，因为在住院患者中，血压和动脉氧饱和度（通过光电容积描记法）通常作为生命体征进行监测。正如我们在描述的猪模型中所示，预设的IV O2剂量最终可以添加到治疗因已知或推测的缺氧引起的院内心脏骤停的患者的复苏算法中。由于这些患者通常在3-5分钟内接受静脉复苏治疗，因此IV O2可能会恢复早期自发循环并显著改善这些患者的预后。这些设置中IV O2治疗的确切剂量和时机需要进一步的研究和优化。
该技术的主要限制是必须施用的液体体积，以传递氧气负载。在这项工作中，泡沫的气体分数在35%到50%之间，可能会进一步优化，就像类似产品所做的那样。然而，考虑到静息氧气消耗率很高（例如，健康成人的消耗量约为250 ml min−1），使用这种技术提供氧气的能力不太可能超过数百毫升，特别是在心脏病患者等危重患者中，即使少量施用也可能加重静脉高压和肺水肿。因此，IV O2应视为在危急情况下静脉注射氧气的策略，以逆转关键生理状态（如心脏骤停或肺动脉高压危机），或为这些患者提供过渡支持（如体外膜氧合支持）。在几分钟内累积的氧气不足可能是影响预后和神经损伤的关键，甚至是生与死的区别。从实验角度来看，另一个重要的限制是，心脏骤停实验中的部分研究团队成员由于患者对治疗的快速明显生理反应而无法对治疗组进行盲法。由于PMB溶液具有明显的白色/不透明颜色，完全掩盖药物也是一个实际挑战。尽管我们本可以将所有注射器和管路进行封闭处理，但在处理注射口或更换注射器时，很难完全掩盖药物，因为注射器的滴液或注射口的残留物是显而易见的。然而，这一限制通过积极测量心肺复苏的质量（在组间没有差异）以及在实验的所有阶段严格遵循治疗协议（包括复苏和生存期间）得到了一定的平衡。最后，安全研究中的动物数量较少，因此我们在检测组间小差异时的能力不足。
展望：
在未来的工作中，PMBs的分子优化可能会进一步加速壳成分的代谢。这可能会减少安全研究中一些动物的脾脏巨噬细胞空泡化现象，这可能是由于聚合物沉淀在酸性溶酶体中（尽管在接受相同聚合物的猪中未观察到此现象）。当前方法的一个重要特征是，聚合物成分的分子结构可以调整（例如，通过降低分子量、增强亲水性或引入酶降解性）以进一步改善药物安全性并最小化潜在的长期不良影响。此外，PMBs还可以通过静脉和其他途径（例如，肠道），用于癌症治疗的氧气输送、神经保护剂（例如氢气）的输送，或超声和MRI对比气体（例如超极化氙气）的输送。
方法：
聚合物合成
将6 kD的右旋糖（20 g）和4-二甲氨基吡啶（64 g）在氮气气氛下加入圆底烧瓶中，然后通过55°C的油浴将其溶解于200 ml无水二甲基亚砜中。将5.6 g的琥珀酸酐和20 ml的醋酸酐分别溶解在60 ml无水二甲基亚砜中，并转移到连接到反应烧瓶的额外漏斗中。在剧烈搅拌下，将无水酐溶液在40分钟内逐滴加入反应混合物中。反应在氮气氛围中维持在55°C下进行12小时，然后进行后处理。将反应混合物在一个包含3 L 6%醋酸水溶液的4 L烧杯中缓慢沉淀，并在剧烈搅拌下进行。通过离心收集所得沉淀，并用离子化水洗涤三次。最后，采用冷冻干燥的方法收集最终产品，得到白色粉末。
氧气充填的PMBs的制造
所有制造过程均在配备垂直层流的生物安全工作台ISO 5级中进行（AirClean System）。所有设备均经过UV消毒，溶液通过高压灭菌预先消毒。用于均质化的储备液以30 wt%右旋糖溶液制备，浓度为11 mg ml−1，每克聚合物加入0.6 ml 1 N氢氧化钠。随后，将LmD溶液放置在冰浴中，使用高功率UV灯在磁力搅拌下对溶液进行2小时的消毒，然后进行均质化。将90 ml的LmD储备液通过量筒转移到1 L的烧杯中，均质化探头（L5M-A实验室搅拌机，Silverson）浸入溶液中，保持在水相/油相界面。将烧杯放置在33°C的水浴中，让溶液在5分钟内平衡至相同温度。随后，将LmD溶液以5500转/分钟的速度均质化；均质化后，溶液立即变成粘稠的白色泡沫。偶尔手动调整烧杯位置，以保持最大且均匀的混合。聚合物溶液先混合2分钟，然后通过移液管添加0.24 ml稀盐酸（HCl）（0.6%）。均质化过程继续，每分钟添加相同量的HCl，持续8分钟（共9次添加酸）。均质化再继续1分钟，并在第11分钟终止。在最后一次添加酸后（约10分钟），观察到泡沫粘度显著降低，表明溶液pH值已降至pKa以下，使大部分羧酸基团质子化，而聚合物交联导致相变。将生成的泡沫在水浴中静置10分钟，然后将150 ml的10%右旋糖溶液倒入泡沫中，以帮助将泡沫混合物从烧杯转移到500 ml的锥形瓶中。将多个批次的LmD泡沫混合并收集到锥形瓶中。让它们静置过夜，LmD PMBs会浮到顶部形成蛋糕状的奶油层，而聚合物残渣则积聚在瓶底。然后使用滚动泵和长不锈钢针siphon 出泡沫底部的液体以及聚合物残渣，随后向厚泡沫层中添加新鲜无菌的D10溶液，通过轻轻摇晃瓶子使其重新分散。这个过程重复3次，来自不同批次的泡沫层进一步混合并浓缩至所需的最终浓度。为了给PMBs充氧，将PMB泡沫置于带有硅胶塞的瓶中，随后通过0.25μm无菌过滤器流动湿氧，冲洗瓶内空间12小时，并偶尔摇动瓶子。通过无菌针头从溶液中抽取少量样品到注射器中，以测量溶液的pO2。完全充氧的PMBs随后被转移并在60 ml注射器中配置至所需浓度，准备进行动物实验的静脉注射。在整个制造过程中均进行了无菌测试。在PMB制造前后，跟踪并测试每个LmD溶液、每个制造批次以及合并的泡沫，通过在血液琼脂平板上培养以监测潜在的细菌生长。只有在培养7天后未出现菌落生长的批次才用于动物实验。
