编辑 | 小杨
撰文 | 小杨
文献信息：
Biomolecular condensates with complex architectures via controlled nucleation
Nature chemical engineering
本周要介绍的文章来自于剑桥大学的Tuomas P. J. Knowles教授课题组。Tuomas Knowles是一位英国科学家，同时是剑桥大学化学系和剑桥大学卡文迪许实验室的物理化学和生物物理学教授。Knowles教授是四家生物技术公司的联合创始人：Fluidic Analytics、Wren Therapeutics、Xampla 和 Transition Bio。他还在2019年被授予剑桥企业学术企业家年度奖。
Tuomas Knowles的研究重点在于理解蛋白质在健康和疾病中的行为。Knowles因其在蛋白质聚集研究方面的工作而出名，他描述了这一过程的动力学和背后的分子机制。他发现了首个完整的淀粉样纤维形成速率定律，这使得全世界的研究人员能够阐明这一过程的机制，并且他与合作者一起为研究社区提供了进行蛋白质聚集动力学分析的软件。
文章摘要
The structure and function of biomolecular condensates are closely related. However, many studies and applications of this relationship are prevented because controlling the mesoscale architecture of condensates can be difficult. Here we introduce a way to create custom multiphase architectures by nucleating new droplets in condensates. This nucleation occurs due to limited diffusion in the dense condensates and a composition change forced upon the system by changing the experimental conditions. The designed architectures are transient states created out of equilibrium. We provide a detailed method for understanding and designing a range of condensate architectures. Access to these long-lived complex architectures will enable researchers to incorporate increasingly sophisticated compartmentalization and functionality in condensates. This general strategy for creating complex structured condensates out of equilibrium may also provide insights into the structure of condensates in cells.
正文内容：
生物分子凝聚体在细胞中执行多种功能，并在生物技术领域中也具有应用价值。分子通过相分离形成不同相，这提供了对空间和时间中反应的更高控制。许多细胞内的凝聚体都有与其功能密切相关的内部架构，例如应激颗粒、核仁、核斑和线粒体核仁体等。不同组成的亚室结构进一步对发生的反应进行了时空控制。
鉴于介观尺度架构与功能之间的密切联系，限制凝聚体可控区域调控是了一个非常具有挑战性的问题。在体外，通过改变凝聚体从热力学稳定状态到区域化的方法是有局限性的。在活体内，我们对细胞非平衡环境对观察到的复杂凝聚体结构的影响理解有限。
在本文中，我们提供了一种方法来理解非平衡结构，并在体外设计具有所需结构的凝聚体。这里的“结构”是指各个相的介观尺度组织——每个相的液滴数量以及它们的位置。通过强制改变凝聚体的组成，我们诱导了我们选择的液滴的成核，并在多相凝聚体模型中创建复杂结构。因此，凝聚体结构成为一个独立的实验变量。设计复杂结构方案将使研究人员能够为生物技术应用、人工细胞以及生命起源研究中纳入越来越复杂的隔室化和功能性。作为一个例子，我们展示了如何通过自定义结构与增大接触面积，从而提高装载分子的吸收率。
结果与讨论：
在本文中，我们探讨了如何设计具有不同介观尺度结构的凝聚体。在热力学平衡状态下，凝聚体可以是终极的黏性或弹性体，而在达到平衡之前，凝聚体可以有各种结构。一个简单的结构将在每个凝聚体中只有每个相的一个液滴，并且界面张力最小。一个复杂的结构将有每个相更多的液滴，并且构成更高的界面面积。
为了研究凝聚体结构，我们使用了一个之前用于人工生命研究的复杂共聚体系统。共聚体通常被用作无膜细胞器的模型。我们的模型系统包含两种经过季铵化或羧甲基化处理的淀粉，分别带有正电荷或负电荷。阴性的单链DNA、一种稳定的三元聚合物、盐和缓冲液也存在于体系中。带正电荷的季铵化淀粉与带负电荷的羧甲基化淀粉和DNA之间的有利的静电相互作用导致多相分离，类似于之前描述的系统，在稀相中形成多相凝聚体。DNA的负电荷密度高于羧甲基化淀粉，导致在凝聚体内形成两个密集相，一个含DNA较少的相和一个含DNA较多的相。季铵化淀粉和DNA在含DNA较多的相中浓度最高，而羧甲基化淀粉在另一个相中最为丰富。
在40°C时，相1包围着凝聚体。凝聚体包含部分包裹着相3的相2。当凝聚体被加热到65°C时，这种结构被保留住。然而，将这些凝聚体迅速冷却回40°C会改变它们的结构。相3中的液滴在相2中成核（黄色箭头头部），而相2中的液滴在相3中成核（橙色箭头头部）。冷却后，我们因此得到了由相2部分包围着相3的液滴组成的凝聚体，其中一些包含相2的液滴。通过比较在40°C准备的凝聚体的结构和那些被加热到65°C后再冷却到40°C的凝聚体的结构，我们观察到凝聚体的结构不是由温度本身决定，而是由达到这个温度的方式决定。有趣的是，将带有成核液滴的凝聚体再次加热到65°C可以去除这些液滴。然后迅速冷却到40°C会再次诱导成核。这个过程至少可以冷却和加热五个周期反复进行。此外，我们观察到，直接在成核后的小成核液滴在大小上非常相似，正如预期。
小成核液滴的存在增加了凝聚体的总界面面积。考虑到界面张力，这意味着有小液滴的结构（图1e）比所有该相的液体都在同一个液滴中的结构（图1c）能量更高。小成核液滴在接触时会融合在一起。因此，带有小成核液滴的结构可以被认为是一个动力学产物或瞬态状态。接下来，我们将探索为什么迅速冷却会导致形成更高能量的瞬态结构。
扩散限制的成核：
使用荧光强度估计了三个相中DNA和淀粉的浓度。投影相图显示在不同温度下三个相中估计的DNA浓度（x轴）和双相线可能的位置（实黑线）。当系统从65°C冷却到40°C时，相1中的DNA含量没有显著变化。冷却减少了相2中的DNA含量，并增加了相3中的含量。降低温度可能会增加DNA的疏水相互作用的相对强度。如果相2从65°C冷却到40°C而不改变组成，它将偏离双相线并进入相图的亚稳态或自旋转态（垂直箭头）。为了回到双相线，溶液需要沿着连线（虚线）进行相分离（曲线箭头）。在相2中成核形成DNA富集的相3的液滴，会耗尽剩余的相2中的DNA，使其达到双相线。同样，相3可能会成核形成相2的液滴来改变其组成。
保持在双相线上会导致能量较低的结构，而当组成偏离双相线时，可以形成高能量的瞬态结构（图1e）。相之间可以通过它们的界面交换分子来改变组成。例如，在冷却过程中，DNA可能从相2穿过它们的界面移动到相3。值得注意的是，与稀释相相比，凝聚体的粘度通常要高出几个数量级，这导致凝聚体中分子运动可能非常缓慢。我们使用荧光恢复后光漂白（FRAP；图2b）测量了DNA和淀粉的扩散系数。这些实验在50°C进行，这是我们观察到从65°C冷却到40°C时液滴成核的大约温度。对于不同的漂白区域，我们测量了恢复时间τ。我们将面积与τ进行拟合以得出扩散系数（图2b）。对于所有三种生物分子，相3中的扩散系数低于相2，表明相3的密度更高，生物分子的浓度更高，与相图中的浓度趋势相匹配。这些分子在凝聚体中经历缓慢的扩散（D = 2-9 μm2 s−1）。作为参考，这与大肠杆菌胞质中绿色荧光蛋白（GFP）的扩散系数相似（7.7 ± 2.5 μm2 s−1）。
鉴于这些凝聚体中扩散缓慢，它们很难响应环境变化来改变组成。在界面上移动分子并交换它们可能不会以所需的速率改变组成。成核液滴提供了一个解决方案。因此，我们预计在快速冷却时，总体上和每单位时间内会有更多的液滴成核。图2c显示了从65°C冷却到40°C时不同冷却速度下的凝聚体的前后状态。实际上，在40°C观察到的成核液滴的数量强烈依赖于冷却速度，当以20°C/min的速度冷却时观察到的液滴比以0.5°C/min的速度冷却时多得多（用黄色箭头头部表示的相3中的相2的液滴，以及用橙色箭头头部表示的相2中的相3的液滴；扩展数据图2c）。值得注意的是，相3在相2中开始成核的液滴与相2和相3之间的界面（白箭头）之间的距离也取决于冷却速度。靠近这个界面的溶液可能会通过界面交换材料来达到新的组成，而不需要成核一个新的相。
随着时间的推移，成核的液滴会互相融合，直到达到较低能量的结构（图2d）。由于通过相2和相3的运动缓慢，成核液滴融合可能需要较长时间。我们通过在40°C孵育期间，定量研究在成核后相2中相3的液滴数量随时间的变化（图2e）来研究这一过程。我们发现，较大的凝聚体中成核液滴的数量更高，这符合预期。此外，通过两个成核液滴的融合（D + D → D）和成核液滴与大的相3液滴的融合（D + P → P），液滴的数量随时间减少。尽管复杂结构是瞬态结构，但由于扩散缓慢，在较高温度下可以持续数小时，这取决于凝聚体的大小。这些凝聚体中的有限扩散，与在细胞中观察到的同一数量级的扩散相同，解释了为何液滴能成核并且长期存在。
预测成核和结构：
快速的组成变化与有限的扩散结合导致液滴成核，从而产生复杂的凝聚体结构。然而，在我们能够有效利用这种机制来设计具有选定结构的凝聚体之前，仍有两个重要问题。首先，我们如何控制成核的体积？其次，我们如何设计具有不同相的成核液滴的凝聚体？接下来，我们将讨论回答这些问题的方法（图3），将其应用于我们的模型系统在温度变化下进行设计（图4），设计具有另一个复杂结构的凝聚体（图5），并展示这种方法在药物传递系统中的应用（图6）。
考虑一个具有组成ϕ的溶液（图3a）。这个点位于分相区内，被双相线（实线）包围。溶液ϕ将沿着连接面（蓝色）经历多相分离，形成具有组成ψ1（圆圈）、ψ2（三角形）和ψ3（正方形）的三个相。系统的结构可能是由相1包围的包含相2和相3的凝聚体。双相线和连接面的位置由分子之间的相对作用力强度决定，这又取决于实验条件。我们现在将改变ψ3（蓝色正方形）的位置，看看这如何可能改变结构。
图3b展示了一个新的连接面（黄色）和ψ3的新位置（黄色正方形）。我们形成的蓝色正方形溶液不再位于双相线上，并希望改变其组成，朝向黄色正方形。值得注意的是，蓝色正方形位于新连接面的边缘上，因此它可以沿此边缘相分离（箭头）成为新的ψ2（黄色三角形）和ψ3（黄色正方形）组成。现在，所有溶液再次位于双相线上。如果我们考虑我们系统的结构，相1和相2没有太大变化。然而，相3现在包含了一些相2的液滴。v是形成的相2的体积分数（0到1），而（1 − v）是相3剩余的体积分数（0到1）。通过质量平衡我们可以找到这些分数，v是从蓝色正方形到黄色正方形的连接面边缘的长度，除以这个连接面边缘的总长度。
现在考虑将我们的系统从图3a变化到图3c的条件。蓝色正方形溶液现在位于新连接面（红色）的另一条边缘上。这个溶液希望改变其组成以最终位于双相线上。为了实现这一点，它将沿连接面的边缘相分离，并成核一个v′体积分数的相1（红色圆圈）并获得新组成的相3的（1 − v′）分数（红色正方形）。在随附的方案中，我们看到相3中的相1的液滴。值得注意的是，计算出的相1的体积分数是可能成核的最大量。如果实验条件缓慢变化，分子可以通过界面交换来改变组成。如果部分通过界面处的分子交换来改变组成，则需要较少的成核。因此，v和v′是最大量，而（1 − v）和（1 − v′）是最小量。
最后，我们将考虑蓝色正方形最终位于新的连接面（绿色）内，而不是边缘（图3d）的情况。类似于三个相最初是如何从ϕ形成的，蓝色正方形可以相分离成ψ1（绿色圆圈），ψ2（绿色三角形）和ψ3（绿色正方形）。体积分数最容易通过首先将溶液分成v′的相1和相2与相3的混合物沿额外的虚线分离来确定。然后，将这种混合物分成v的相2和（1 − v − v′）的相3。方案现在展示了包含相1和相2的液滴的相3。
通过构建具有连接面的相图，我们可以非常详细地预测凝聚体结构。我们可以了解成核液体的组成，在哪些溶液中它们将出现，以及它们的最大体积分数是多少。在我们的例子（图3）中，三种分子α、β和γ在三个相中不同程度地分配。为了准确计算体积分数并减小误差，所有在相中浓度显著不同的化合物都应纳入相图中。接下来，我们将应用这种方法来理解当改变温度（图1e）时，在我们的模型系统中的成核事件。
理解复杂结构：
图4a展示了我们模型系统在65°C时的相图（共聚焦图象在图1d，条件A）。总组成ϕ通过连接面（蓝色）分离成三个相ψ1，ψ2，和ψ3。然后系统被冷却到40°C，或条件B（图4b）。现在，双相线和连接面（黄色）已经移动。蓝色正方形和蓝色三角形溶液位于连接面的红色边缘上。ψ2A将分裂形成最多0.20ψ3B和最少0.80ψ2B。类似地，ψ3A将分裂形成最多0.07ψ2B和最少0.93ψ3B。我们预测，给系统更多时间通过相2和相3之间的界面交换分子，将导致较小的成核体积。通过量化不同大小的八个凝聚体的体积分数来测试这些预测。实际上，我们观察到小凝聚体不成核或有一个小的体积分数，而较大的凝聚体接近预测的最大/最小体积分数。鉴于相2和相3沿着连接面的红色边缘改变组成，没有理由在温度变化期间成核相1，也没有观察到此类事件。有趣的是，如果由于加热而不是冷却，相反方向的组成变化发生了，我们会预测相2与相3的混合而不是成核。这解释了我们观察到加热时成核液滴消失的情况（扩展数据图2）——它们溶解或与周围液体混合。
使用控制的成核设计复杂结构：
也可以使用这种方法设计新的结构。利用质量平衡，我们探索了相2（图4c）和相3（图4d）的这些选项。图例在图4e中提供。注意，在图4c,d中，改变组成的相由正方形表示，以确保图例适用于两者。当改变正方形相的组成到相图中的另一个位置时，此位置的颜色显示了要成核（红色阶梯）或混合（绿色阶梯）的最大量三角形相，以及要成核（蓝色阶梯）或混合（黄色阶梯）的最大量圆形相。沿着红色连接线，预测将成核其他密相，而沿着蓝色连接线我们期待稀相的液滴成核。通常，将组成从圆形或三角形的组成进一步移开可以导致圆形或三角形的成核。向它们移动需要混合。有了这个背景，我们现在可以设计具有我们选择的结构的凝聚体。
作为一个例子，我们着手准备包含相1和相2的液滴在相3中，以及相1和相3的液滴在相2中的凝聚体。这需要相2在组成上向较低的DNA浓度和较高的淀粉浓度移动（图4c,e）。相3在DNA和淀粉的浓度上都应该变得更密（图4d,e）。我们假设通过降低离子强度可以实现这种变化。离子筛选电荷并减少静电相互作用的强度。因此，预期降低离子强度将增加相2和相3与相1相比的淀粉浓度，并增加与Q-淀粉更强烈相互作用的相3中的DNA浓度，与相2相比。
图5a,b展示了在165mM KCl的室温下，带有荧光标记的DNA、Cm-淀粉和Q-淀粉的凝聚体的代表性例子。之前的实验是在更高的温度和100mM KCl下进行的。在165mM KCl下，我们获得了一个多相凝聚体。我们稀释了这个样本以获得在55mM KCl中的凝聚体（图5c,d和扩展数据图6）。迅速降低盐浓度导致形成了一个复杂结构的凝聚体。最容易在显示所有化合物的图像中看到，相1的液滴在相2中（灰色箭头）和相3中（白色箭头）成核。此外，相3的液滴在相2中（黄色箭头）和相2的液滴在相3中（橙色箭头）成核（在图5d，DNA通道中最易见）。值得注意的是，只稀释溶液而保持盐浓度不变并不会导致这种结构的形成。立即在55mM KCl下准备的凝聚体也没有这种复杂结构。这一发现特别是由于将盐浓度降低到55mM，使我们在相3中成核了相1和相2，以及在相2中成核了相1和相3的液滴，确认了我们的预测。
我们可以使用图3d的方法来找出我们可以在相2（图5e）和相3（图5f）中成核的理论最大体积分数。165mM的组成在蓝色显示，而55mM的组成和连接面在黄色显示。相2将成核最大0.29体积分数的相1和最大0.09体积分数的相3。相3将成核最大0.22体积分数的相1和最大0.20体积分数的相2。在实验中（图5c,d），我们观察到比理论最大值小的成核量，这可能是由于界面上的物质交换促进了组成的变化。在距离界面很短的距离内，我们倾向于观察到根本没有成核。这最容易在图5c中看到，相1的成核是从与相1的凝聚体界面有一定距离的地方开始的。扩展数据图8显示了从165mM KCl开始的更详细的预测。
所呈现的方法解释了观察到的复杂结构（图4），并且使得设计具有选择的复杂结构的凝聚体成为可能（图5）。在初始条件下准备凝聚体，然后迅速改变这些条件，可以获得临时但通常是长期存在的结构。使用连接线或平面的相图可以规划要创建哪种复杂结构。如果偏好具有更大体积分数成核液滴的结构，可以增加施加环境变化的速率（图2b）、创建更大的凝聚体（与界面的距离更大，图2b）、使用更密的液体（成核是由扩散限制的；更低的扩散系数减小了临界距离，图2c）或强制更大的组合变化（图3）。如果希望一个瞬态结构保持更长时间，可以使用更大的凝聚体（图2e）或在较低温度下储存它们（扩散和融合更慢）。
复杂结构的应用：
作为一个例子，考虑到凝聚体被用作药物传递系统的情况。对于这个应用来说，控制货物吸收和释放的速率很重要。我们着手将我们的载荷，GFP，加载到相3中。首先，我们测试了凝聚体吸收GFP、带有30个负电荷残基的超荷电GFP（-30GFP）、以及与20核苷酸的ssDNA链结合的增强型GFP（DNA-GFP）的能力（补充方法和图6a）。我们发现，将DNA与我们的载荷结合，使其能够被凝聚体的相3吸收（图6b）。其次，我们创建了12个界面面积小（图6c）和12个界面面积大但最终条件相似的凝聚体（图6d）。第三，我们将DNA-GFP添加到凝聚体中，并研究了从相1到2到3的吸收情况。我们发现，具有更大界面面积的凝聚体将载荷吸收到相3的速度明显更快。对于24个凝聚体中相3中GFP的平均强度随时间的变化进行绘图，并作为一级反应进行拟合（图6e）。简单结构的吸收时间为τ=30±1分钟，复杂结构的吸收时间为τ=4.1±0.2分钟——快了七倍多。因此，能够作为独立变量控制凝聚体的结构，也赋予了对界面面积和交换速率的控制。当在创建复杂结构之前添加货物时，发现在相3的大小不同的液滴中，货物的浓度相等，确认了大小影响吸收速率，而不是最终浓度（扩展数据图9）。
结论与讨论：
通过在凝聚体中使用受扩散限制的成核，可以获得瞬态多相结构。利用相图和连接平面，人们可以理解这些结构是如何形成的，并设计新的结构。可以规划哪些组成变化导致哪些成核或混合事件，并确定涉及的最大体积分数。复杂结构可以是长寿命的结构。获得复杂结构的能力将使研究人员能够将越来越复杂的隔室化和功能整合到各种应用的凝聚体中。此外，洞察复杂结构如何在非平衡条件下产生，可能有助于理解凝聚体的动态行为和结构多样性。
这意味着，通过对凝聚体内部的精细解析和设计，科学家们可以探索新的方式来构建具有特定功能的材料系统，从而在生物医学、材料科学、化学工程等众多领域内开辟新的应用前景。例如，在药物递送领域，通过创建具有特定结构的凝聚体，可以实现对药物传输速率和释放模式的更精确控制，从而提高治疗的效果并减少不良反应。
此外，这种对凝聚体结构的深入理解和控制，还能够为我们提供一种新的视角，用于研究细胞内复杂结构的形成机制以及它们在生物过程中的作用，从而对基础生物学领域带来深远的影响。通过模仿生物体内的微环境，研究人员可以更好地模拟和理解生命过程，在细胞生物学和组织工程等领域提供创新的解决方案。
综上所述，探索和利用凝聚体的复杂结构不仅为高级功能材料的设计和应用提供了强大的工具，也为我们提供了理解和操纵自然界中复杂现象的新途径。
方法：
材料
除非另有说明，否则所有化学品均按收到的状态使用。聚（乙二醇）单甲醚（2kDa）由RappPolymere购买，三亚甲基碳酸酯（1,3-二噁烷-2-酮）由Actu-All Chemicals购买。淀粉（12-16kDa）由Carbosynth提供，（3-氯-2-羟丙基）三甲铵氯化物（65％重量百分比在水中）由TCI Europe提供。DBCO-Cy3和DBCO-Cy5由ThermoFisher购买。38核苷酸长的单链DNA和经HPLC纯化、标记有FITC或Cy5的38核苷酸长的单链DNA（5' TTTTTTTTTTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCCATAAGG）由Integrated DNA Technologies（IDT）获得。所有其他化学品和试剂由Sigma-Aldrich供应。
多相凝聚体的形成
Q-淀粉、Cm-淀粉和三元共聚合物的修改和合成，以及GFP变体的表达和DNA-GFP偶联在补充资料中描述（扩展数据图10）。Q-淀粉和Cm-淀粉以1mg/ml的浓度分别溶解在缓冲液中（20mM HEPES, 100mM KCl, pH 7.5）。DNA溶解在Milli-Q水中，最终浓度达到250μM，其中2.5μM要么用FITC标记，要么用Cy5标记。图6和扩展数据图9使用了Cy5标记的DNA。在其它情况下，则使用FITC标记的DNA。为了准备凝聚体，将50μl缓冲液、25.3μl Cm-淀粉和3.2μl ssDNA溶液在低DNA结合管中混合，然后在室温下摇动混合，加入24.7μl Q-淀粉溶液（1500转/分钟），以获得2.1:1的淀粉电荷比（Q-淀粉:Cm-淀粉）。1分钟后，加入100nM GFP变体进行实验。6分钟后，向溶液中加入三元共聚物（2.5μl, 50mg/ml在PEG350中），以稳定凝聚体。样品放在带盖的Ibidi滑片中，以防加热过程中水份蒸发。
共聚焦显微镜
图1和2，以及扩展数据图1、2、4和5中的图像，是使用装备有×63油浸式Leica 1.4 NA物镜的Leica Stellaris 5共聚焦显微镜（白光激光）拍摄的。图5和6以及扩展数据图6、7和9中的图像，是使用装备有488-nm、552-nm和638-nm激光，混合探测器（HyD）和光电倍增管（PMT）探测器，以及HC PL APO CS2 ×20/0.75干式物镜的Leica TSC SP8共聚焦显微镜拍摄的。冷却和加热实验是使用TS102SI Instec快速加热和冷却台进行的。相图中的浓度是基于与相同pH、盐浓度和温度的参考样品的荧光强度比较估算的。确定的浓度是估算值，因为没有考虑粘度对染料强度的影响等因子。
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